M13 噬菌體單鏈 DNA 是從感染細胞分泌至周圍培養液中的病毒顆粒中制備的，首先在高鹽存在下，絲狀病毒被聚乙二醇（PEG) 沉淀濃縮，然后用酚抽提釋放單鏈 DNA，最后乙醇沉淀收集單鏈 DNA。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | M13 噬菌體單鏈 DNA 是從感染細胞分泌至周圍培養液中的病毒顆粒中制備的，首先在高鹽存在下，絲狀病毒被聚乙二醇（PEG) 沉淀濃縮，然后用酚抽提釋放單鏈 DNA，最后乙醇沉淀收集單鏈 DNA。 |
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| 實驗材料 | M13 單鏈噬菌體載體感染 M13 噬菌體的大腸桿菌培養物未感染的大腸桿菌的培養 |
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| 試劑、試劑盒 | 氯仿乙醇酚聚乙二醇 8000乙酸鈉蔗糖凝膠上樣緩沖液TE |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠多管振蕩器 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
氯仿
乙醇
酚
聚乙二醇 8000 ( 20%，m/V，PEG 8000 ) 溶于 2.5 mol/L NaCl。
乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE ( pH 8.0)
2. 凝膠
瓊脂糖凝膠（1.2%) 懸于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
3. 核酸和寡核苷酸
重組 DNA 的 M13 單鏈噬菌體載體
4. 專用設備
多管振蕩器（可選）
5. 載體和菌株
感染 M13 噬菌體的大腸桿菌培養物
未感染的大腸桿菌的培養
二、方法
PEG 沉淀噬菌體顆粒
1. 分別將 1 ml 感染和未感染培養物加入兩個微量離心管，以最大轉速室溫離心 5 min, 室溫下，將上清分別轉入兩個新微量離心管。
2. 上清中加入 200 μl 溶于 2.5 mol/L NaCl 的 20% PEG，顛倒離心管數次混合溶液，溫和振蕩，室溫放置 15 min。
3. 在微量離心機上，以最大轉速 4℃ 離心 5 min，回收噬菌體顆粒沉淀。
4. 用連接于真空裝置的一次性移液器頭或裝有橡皮球的長巴斯德吸管小心地吸去所有上清后，再離心 30 s，去除所有殘存的上清。
酚抽提單鏈 DNA
5. 用 100 μl TE ( pH 8.0) 振蕩重懸噬菌體顆粒沉淀。
使沉淀完全重懸的最好方法是用 TE 室溫浸泡沉淀 15~30 min，接著低速振蕩溶解沉淀。使噬菌體顆粒沉淀完全重懸對下一步用酚有效地抽提單鏈 DNA 非常重要，如果同時提取多個樣品，則使用多管振蕩器省時又省力。
6. 在沉淀懸液中加入100 μl 平衡酚，振蕩 30 s 充分混合，室溫放置 1 min，再振蕩 30 s。
7. 在微量離心機上，以最大轉速離心 3~5 min。在方便的前提下，盡可能多地將上層水相轉移至一個新微量離心管。
為了便于分相，可加入 30 μl 硅潤滑油。這一步驟有時可提高產量，但通常是不需要的。不要試圖轉移全部水相，當約 5 μl 水相留在界面時，制備的單鏈 DNA 更干凈。
用一次酚抽制備的模板可用于大多數用途（包括 DNA 測序)，一般不需再進行酚抽。但是，如果在步驟 3 噬菌體沉淀污染有FEG/NBa 上清的組分，則會影響雙脫氧測序反應的重現性，并使每個反應測定的可靠長度下降至 300 bp 或更少。特別注意去除微量離心管中的痕量上清可以避免這個問題。另外有些研究者還在步驟 6 離心分相前，在每個離心管中加入 100 μl 氯仿，再振蕩混合；或同步驟 7 將水相轉移到一個新的微量離心管，再用 100 μl 氯仿抽提水相一次，離心分相，將水相轉移至一個新的微量離心管。
乙醇沉淀噬菌體 DNA
8. 存在 0.3 mol/L 乙酸鈉的條件下，用標準的乙醇沉淀法回收 M13 DNA。短暫振蕩混合后，室溫放置 15~30 min 或 -20℃ 過夜。
轉移至新離心管的酚抽水相可能會略渾，但加入乙酸鈉溶液后應清亮。
沉淀單鏈 DNA 也可加入 300 μl 無水乙醇：3 mol/L 乙酸鈉為 25:1 的混合物，然后室溫放置 15 min。這個方法不需要分別加乙酸鈉和乙醇，因而在許多單鏈 DNA 樣品純化時，可以加快操作步驟。M13 DNA 可以在乙醇中 -20℃ 存放數月。
9. 在微量離心機上以最大轉速 4℃ 離心 10 min 回收單鏈噬菌體 DNA 沉淀。
10. 輕輕吸去上清，小心不要觸動 DNA 沉淀（經常只是能在管壁上看到的一點模糊痕跡)，再離心 15 s，去除所有殘留的上清。
11. 加 200 μl 70% 冷乙醇，以最大轉速 4℃ 離心 5~10 min。立刻輕輕吸去上清。
重要：在這一步，沉淀粘在管壁上并不牢固，因而操作務必要既快又小心，以免 DNA 丟失。
12. 倒置開蓋的離心管 10 min, 使所有殘留的乙醇流出和蒸發。用 40 μl TE ( pH 8.0）溶解沉淀，37℃ 溫育 5 min 以加速 DNA 溶解。DNA 溶液 -20℃ 保存。
單鏈 DNA 的產量通常是 5~10 μg/ml 原始感染培養物。
13. 數個樣品的 DNA 濃度的估計可各取步驟 12 制備的 DNA 溶液 2 μl 加蔗糖凝膠加樣緩沖液 1 μl 混合后加至含 0.5 X TBE 和 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 1.2% 瓊脂糖凝膠的加樣孔。用不同量的已知濃度的 M13 DNA 作為對照。6 V/cm 電泳 1 h, 根據熒光光密度的強弱估計 DNA 的量。
采用染料標記引物的每套四個雙脫氧測序反應中通常需要 2~3 μg 標準的 M13 噬菌體 DNA 制品。 |
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