| 注意事項 | 1.所有的試劑必須用電阻高于 17. 6 的雙蒸水配制。
2.提取 RNA 所用的玻璃器具必須于 180°C 烘烤至少 8 h 以滅活 RNase。除緩沖液外的所有溶液都要用 0 ?1 % DEPC水 配 制（見注釋 3)。 RNase 的污染主要來源于實驗人員的手，所以進行 RN A 實驗時需要戴一次性手套。
3.DEPC 可與胺迅速反應，所以不能用來配制含有緩沖成分的溶液，比如 Tris 等。可用新鮮啟封的 Tris 結晶物制備無 RNase 的溶液。
4.DEPC 可能致癌，應小心使用。 .
5.R N A 的濃度可以通過取部分終產物測 OD26。確定。 OD26 q 為 1 的溶液中含 RNA約 45 / ig/mL。
6.甲基化的 dCTP (5'-methyl dCTP) 代 替 dCTP 進 行 cDNA的第一鏈合成反應，防止片段內的 XAo I 位點被酶切
7.由于睡菌體Fl 的 gene II 內切酶（M13 gpH protein; LifeTechnologies) 已經不再生產，可 以 用 位 點 特 異 性 的 內 切 酶 N.BstT9 (BIORON GmbH, Ludwigshafen, Germany) 代替。反應體系為 5 pg 質粒 DNA， 20 U N.BstT9 和N.BstT9 緩 沖 液 [BI0 R0 N GmbH, 10 mmol/L Tris-HCl， pH 8. 5, 10 mmol/L
MgCl2， 150 mmol/L KC1， I minol/L DTT， 0 ?I mg/mL 牛血清白蛋白（BSA)]混合，加水調整體積至 50 ^ xL, 于 55°C反 應 30 min。
8.挑選出的克隆數量取決于基因組大小和（或）實驗目的。如果要制備一套好的擬南芥 cDNA (擬南芥全基因組大小約為1. 25 XIO8 bp), 就必須要在均一化的cDNA文 庫（cDNA的平均長度約為 2kb) 中挑選不少于 3 X 106 個克隆。總體上，要得到一套較好的cDNA —般需要挑選 5 倍于基因組大小的克隆。
9.當比較多套基因表達數據時，宏陣列所用的膜經常要重復使用。用 1 % SDS 煮膜 30 min 能夠有效地洗脫。由于這種方法對膜的物理損傷和膜上 cDNA 量的損失 ，膜的重復使用不得超過 5 次。 Homgerg 等采用了一種較為溫和的方法(I6)。由于較短的cDNA 鏈解鏈溫度也相對較低，經過氧化降解后，用他們的方法可以在相對低一些的溫度洗脫，這樣就可以減少溫度引起的損傷。根據他們文中所述，同樣的膜用這個方法即使重復洗脫 10 次也檢測不出損失。
10.宏陣列膜的雜交效率受探針精確度、 R N A 質量和膜反復使用的次數影響。用高質量的 R N A 和新的膜及 3. 3 所述雜交體系就可以很好地完成實驗。但是當信號強度較弱或者膜用作其他用途時，建議膜的洗脫溫度應低于 65°C 。例如，當以擬南芥 d D N A 文 庫制備的 c D N A 宏陣列用于檢測其他物種，比如芥菜(Brasska na 外《) 或 小 麥（數據未發表）的基因表達譜時，建議洗脫溫度應低于 42°C 。相反，如果所有點的信號強度都很強，則可提髙溫度再洗一次。
11.在 3 中，我們提出用全局均一化法來均一化陣列信號，但最近剛剛發表了一種更精確的方法（lognormal distribution fitting method) 來評估數據質量和均一化（17）。 |
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