DNA文庫的構建及其篩選

DNA

升汞MS培養基瓊脂糖EcoR IHind IIIBamH IBg lIIPst I

電泳儀尼龍膜

1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取參照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分離總基因組DNA并略有修改。 通過 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳測定分子量。

2.基因文庫的構建。以限制性內切酶γEcoRI 消化水稻基因組 DNA12 h, 然后從膠中回收 0.5~ 8kb片段, 連接到γExCell EcoR I/ CIP載體上, 體外包裝并感染受體菌NM522。

3.基因文庫的鑒定。挑取 50個新鮮的白色噬菌斑, 分別加入 150ul SM buffer , 按γExCell 試劑盒說明書進行質粒釋放, EcoRI 酶切鑒定基因組 DNA 插入片段的大小。

4.水稻基因組。DNA 的非同位素標記標記程序按地高辛標記檢測試劑盒探針標記程序進行。

5.噬菌斑原位雜交。噬菌斑轉膜、固定均參照分子克隆方法 。預雜交, 雜交以及高靈敏度的洗滌尼龍膜均在雜交爐 (Biometra) 中進行。雜交信號的檢測按照 Boehringer Mannheim 的使用說明書進行。

6.點漬雜交。選取噬菌斑原位雜交信號較強的 200 個克隆進行質粒釋放。 質粒釋放程序參照γExCell 試劑盒說明書進行。 然后按堿裂解法小量提取重組質粒。將 200 個重組 DNA 各取 1ul 依次點在尼龍膜 上, 固定后以 Dig 標記的基因組 DNA 為探針進行點漬雜交。 從中選取 40 個雜交信號較強的重組子, 再次進行斑點雜交。

7.Southern 雜交。選取第三輪點漬雜交信號強的 10 個重組子標記為探針. 基因組 DNA 酶切采用 5 種常用的限制性內切酶: EcoRI、H indIII、BamH I、Bg lII 和 PstI。常規瓊脂糖凝膠電泳分離, 通過電轉 移儀將酶切片段從瓊脂糖凝膠中轉移到尼龍膜進行 Southern 雜交。

產生 DNA片段的方法要求切點隨機性高，使任一基因都可能被完整地克隆，并且最好在兩側都留有粘性末端以利于 DNA片段間的連接。機械剪切方法的優點是隨機性高，可是所得片段兩端沒有粘性末端，有時較為不便與載體連接。用限制性核酸內切酶酶解的隨機性較差，但是兩端有粘性末端,便于和載體相連接。

因文庫的保存和利用 　為了有效地保存基因文庫，可通過細菌的繁殖而使包含各個特定 DNA片段的細菌增多。液體培養不適用于這一目的，因為各個細菌的生存和繁殖能力不同，各個克隆被保存的機會也會因此而不相等。在固體培養基上每一個細菌單獨形成一個菌落，各個細菌并不相互干擾和競爭，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一個菌落中大約包含10⁷個細菌，這樣一個基因文庫中的所有的克隆幾乎都擴增了10⁷倍。把培養皿上的細菌全部洗下加以保存，便可以在需要時從中取得任何一個克隆。