FISH基本技術和問題解決

Carnoy 固定液乙醇細胞懸液2 X SSC預熱的胃蛋白酶工作液磷酸鹽緩沖溶液變性液雜交后洗脫液DAPI 復染液

水浴鍋增濕器塑料保鮮膜濕度計試管架無塵紙相差顯微鏡干燥箱DNA探針鑷子雜交濕盒溫箱

一、制備培養的中期細胞標本

1.在一個獨立小室里放置一個水浴鍋和一臺增濕器。濕度應大約 50%，如果房間濕度計顯示低于 45%，則應使用加濕器。

2.預熱水浴鍋至 67°C±2°C，在水浴鍋中央放置試管架以使碰不到水浴鍋邊緣，整個操作過程保持水位剛好在試管架頂端之下。

3.用 Carnoy 固定液調整細胞懸液的濃度，使懸液輕度混濁即可（見注釋 3)。

4.用 70% 乙醇清洗載玻片的兩面，用無塵紙將玻片擦干。

5.將清洗過的玻片浸在一缸水中，傾斜載玻片使水均勻覆蓋在片子上表面。

6.立刻將片子移至水浴鍋上方，拿一支 2~4in(lin=2.54 cm) 的巴斯德吸管，在片子上方沿片子長邊滴 3 或 4 滴細胞懸液。

7.將片子放置在水浴中試管架的頂端，有標本面向上，讓片子干燥 5~IOmin08. 將片子拿開，在相差顯微鏡下觀察，必要時調整滴片條件。

二、使用可調節細胞遺傳干燥器制備中期染色體標本（見注釋 4)

1.打開溫差電偶真空計，將溫度設定為 22°C 和相對濕度設定為 44%，并使之達到穩定狀態。

2.用 Camoy 固定液調整細胞濃度，使懸液呈微混濁狀（見注釋 5)。

3.用 70% 乙醇清洗載玻片兩面，并用無塵紙擦干，將片子放置在溫差電偶真空計的內表面。

4.握住一支 2~4in 巴斯德吸管，在片子正上方沿著片子的長邊滴 3 或 4 滴細胞懸液。

5.觀察懸液干燥的情形。懸液在 45~60s 內干燥的情況下制備的標本質量一般較好。

6.在相差顯微鏡下觀察，必要時調整滴片條件。

三、制備未經過培養的標本（見注釋 6)

1.小心重懸固定的細胞。

2.每個雜交區域滴 15~20uL 細胞懸液（通常每張片子滴兩個區域）

3.氣干標本。

4.在相差顯微鏡下檢驗細胞密度，如有必要重復 2 和 3 步。

5.過夜老化或在 73°(：的 2\83(：溶液中保溫 21^11(見注釋 7)。

四、制備尿道上皮細胞標本

1.小心重懸細胞并分別滴 3ul、10uL 和 30uL 懸液在加蓋載玻片的 3 個孔中。

2.氣干標本。

3.確定哪個樣品的細胞密度最佳，即擁有足夠數量的非重疊細胞。

4.在相差顯微鏡下面觀察細胞密度，并選擇合適的孔進行雜交。

5.過夜老化或在 73°C 的 2XSSC 溶液中保溫 2 min(見注釋 7)。

五、新鮮細胞的預處理

1.將標本在 73°C 的 2XSSC 中浸泡 2 min。

2.將標本在 37°C 的胃蛋白酶工作液中浸泡 lOmin。

3.將標本在室溫的 PBS 中洗 5 min。

4.室溫下將標本在處理后固定液中放置 5 min。

5.將標本在室溫的 PBS 中洗 5 min。

6.將標本自然風干。

7.將標本在 70% 的乙醇中室溫下浸 lmin。

8.將標本在 85% 的乙醇中室溫下浸 lmin。

9.將標本在 100% 的乙醇中室溫下浸 lmin。

10.可以進行標本變性。

六、石蠟標本的預處理（見注釋 8)

1.用鉆石筆標出待雜交的石蠟區域。

2.室溫下將標本在 Hemo-De 清理試劑中浸 lOmin。

3.將標本在 Hemo-De 清理試劑中重復洗 2 次，每次都使用新鮮的 Hemo-De 清理試劑。

4.室溫下，將標本在 100% 乙醇中脫水 5 min。

5.換新的乙醇重復步驟 4。

6.將標本自然風干或將片子在 45?50°C 的片子加熱板上放置 2?5 min。

7.將標本在 0.2mol/LHCl 中浸 20 min(見注釋 9)。

8.將標本在純水中浸 3 min。

9.將標本在洗脫緩沖液中浸 3 min。

10.將標本在 80°C 預處理液中浸 30 min。

11.將標本在純水中浸 lmin。

12.將標本在洗脫緩沖液中浸 5 min。

13.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

14.用紙巾從載玻片邊緣蘸去多余的洗脫緩沖液。

15.將標本在 37°C 的蛋白酶溶液中浸泡 IOmin(見注釋 10)。

16.將標本在洗脫緩沖液中浸 5 min。

17.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

18.將標本在 45~50°C 的標本電熱板上干燥 2~5 min。

19.將標本在中性福爾馬林緩沖液中室溫浸泡 IOmin(見注釋 11)。

20.將標本在洗脫緩沖液中浸 5 min。

21.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

22.將標本在 45?50°C 的標本電熱板上干燥 2?5 min。

23.可繼續進行雜交操作程序。

七、雜交和洗脫

一定要協調好準備探針的時間和標本變性時間，以便同時完成以備雜交。

1.將標本在 73°C 變性液中浸泡 5 min。一個染缸內一次最多變性 4?6 張載玻片（見注釋 12)。

2.將標本浸在室溫的 70% 乙醇中 lmin。

3.將標本浸在室溫的 85% 乙醇中 lmin。

4.將標本浸在室溫的 100% 乙醇中 lmin。

5.用吸水紙從載玻片的邊緣吸取多余的乙醇并用紙巾將玻片背面擦干。

6.將探針分裝到一個微量離心管中并蓋緊，將探針在 73°C 水浴中變性 5 min。

7.在標本上的目標區域加 3~10uL(根據樣品區域而定）探針混合液（見注釋 13)。

8.立刻在探針上覆蓋以 22 mmX22 mm 或一個 12 mm 圓形（本章 3.4 泌尿上皮細胞雜交）蓋玻片使探針均勻分布。

9.用橡皮泥封住蓋玻片周邊。

10.將標本放在 37°C 預熱的濕盒中。

11.將雜交標本在 37°C 保溫過夜（14?18 h，見注釋 14)。

12.用鑷子輕輕撕除封片膠。

13.室溫下，將標本浸在雜交后洗脫緩沖液中并洗掉蓋玻片。

14.從載玻片的一端吸除過量的液體。

15.將載玻片在 73°C 的雜交后洗脫緩沖液中浸洗 2 min。每個染缸一次不得洗脫超過 4?6 張非福爾馬林固定的標本，在 2XSSC/0.1%NP-40 中室溫浸洗 Imin(見注釋 14)。

16.取出片子，將片子垂直放置于暗處風干。

17.加 IOjaLDAPI 復染液到目標區域并蓋上 22 mmX22 mm 蓋玻片。

18.雜交后標本置于暗處保存。不使用時于一 20°C 保存。

八、間期細胞的信號計數

使用下列各項標準評估片子是否合適（見注釋 15~20)。

1.探針信號強度：信號應該是明亮、清晰和易于評估。信號應該是緊密的橢圓形或線狀、彌散的橢圓形。

2.背景：背景應該呈深暗或黑色，很少有熒光顆粒或是霧狀。.

3.靶信號的識別：使用指定的濾光片。調整焦距，而且要熟悉靶信號和背景噪聲 (碎片）的大小和形狀。

4.使用 40 乂目鏡，掃描一些區域估計細胞類型的異質性。選擇一個核分布均勻的區域，避幵靶信號弱的區域。

5.使用 63X 或 IOOX 目鏡，開始分析選定區域左上象限，并從左向右掃描，依照指導原則在每個清晰可辨的間期細胞核邊界內計數信號。

6.上下調節焦距找到核內所有信號。

7.大小相同，相距小于或等于單個信號直徑可計為兩個信號。

8.不要對沒有信號或當使用兩種或更多不同熒光素只有一種顏色信號的核進行計數。只記人那些每種顏色有一個或多個 FISH 信號的核。