光化學交聯技術是研究核搪核蛋內復合物中 RNA 與蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未經任何化學修飾的 RNA -蛋白天然復合物在短波長紫外線（254 nm ) 照射時，RNA 中的核苷酸和蛋白質中的氨基酸會產生光化學反應，轉變為活性狀態，進而形成分子間共價交聯。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 光化學交聯技術是研究核搪核蛋內復合物中 RNA 與蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未經任何化學修飾的 RNA -蛋白天然復合物在短波長紫外線（254 nm ) 照射時，RNA 中的核苷酸和蛋白質中的氨基酸會產生光化學反應，轉變為活性狀態，進而形成分子間共價交聯。 |
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| 實驗材料 | FPLC純化的核苷酸Sephadex G-50 |
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| 試劑、試劑盒 | 緩沖液A甘油乙酰化牛血清白蛋白緩沖液B緩沖液C肝素緩沖液F酚氯仿異戊醇無RNase的DNaseI疊氮苯酰溴緩沖液D緩沖液CTBE緩沖液蛋白上樣緩沖液SDS變性聚丙烯酰胺凝膠轉移緩沖液銀染試劑 |
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| 儀器、耗材 | 紫外光源號離心管X 射線片增感屏硝酸纖維素膜電轉移裝 |
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| 實驗步驟 | ―、材料與設備
1. 全長含核苷酸類似物的 RNA 合成
所有的緩沖液配制均需采用經過蒸餾并滅菌的去離子水
(1) 緩沖液 A：20 mmol/L Tris-HAc ( pH 8.0 )，10 mmol/L Mg(Ac)2，50 mmol/L 谷氨酸鉀。
(2) 5% (V/V) 甘油，40 mmoI/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，40 μg/mL 乙酰化牛血清白蛋白，-20℃ 保存。
(3) 緩沖液 B：1.5 mol/L NH4Ac，37.5 mmol/L Na2EDTA( pH 8.0 )，50 μg/ml 無RNase 的 tRNA，20℃ 保存。
(4) 緩沖液 C (2X)：8 mol/L 尿素，0.1% (m/V) 二甲苯青，0.1% (m/V) 溴酚藍。
(5) FPLC 純化的核苷酸，ATP，CTP，GTP，UTP，-80°C 保存。
(6) 5-SH-UTP，5-SH-CTP，5-APAS-UTP 和 5-APAS-CTP 配制成 1~3 mol/L 的水溶液，-80℃ 避光保存。
(7) T7 噬菌體 RNA 聚合酶或大腸桿菌 RNA 聚合酶。
(8) [ α-32P ] GTP 的工作濃度范圍為 105 cpm/pmol~107 cpm/pmol。
(9) 1 mol/L NH4Ac 以無水乙醇配制，室溫保存。
(10) 肝素：0.5 mg/ml 水溶液，-20°C 保存。
(11) 緩沖液 F：40 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，15 mmol/L MgCl2，10 mmol/L β-巰基乙醇，乙酰化牛血淸白蛋白。
(12) 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1 )。
(13) 80% (V/V) 乙醇。
(14) RQ1 無 RNase 的 DNase I ( Promega 公司）。
(15) 紫外光源號：Spectroline model XX-15B，Spectroline 公司）。
(16) 1 ml 離心管。
2. 分子表面摻入具光交聯活性的核苷酸類似物的 RNA 合成
(1) 100 mmol/L 疊氮苯酰溴（Azidophenacyl bromide，APB，Sigma 公司）溶于硫酸二甲酯。
(2) Sephadex G-50，DNA 級。
(3) 緩沖液 D：30 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0 )，10 mmol/L KCl，0.5 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )。
3. RNA 與蛋白的交聯
(1) 緩沖液 C（2X）：8 mol/L 尿素，0.1%（m/V）二甲苯青，0.1%（m/V）溴酚藍。
(2) 10X TBE 緩沖液：0.89 moI/L Tris 堿，0.89 mol/L 硼酸，20 mmol/L EDTA，室溫保存。
(3) X 射線片。
(4) 增感屏。
(5) RNase T1 消化緩沖液：25 mmol/L 檸檬酸鈉，1 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，-20°C 保存。
(6) RNase T1。
(7) 2X 蛋白上樣緩沖液：60 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0 )，60 mmol/L DTT，3.4% (m/V) SDS，17% (V/V) 甘油， 0.02% (m/V) 溴酚藍；DTT 臨用前加。
(8) SDS 變性聚丙烯酰胺凝膠。
(9) 轉移緩沖液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸，20% (V/V) 甲醇，4℃ 保存。
(10) 硝酸纖維素膜。
(11）電轉移裝。
(12) 銀染試劑：2% (m/V) 檸檬酸鈉，0.8% (m/V) 硫酸亞鐵，0.1% (m/V) 硝酸銀，4℃ 保存。
二、操作方法
1. 全長含核苷酸類似物的 RNA 合成
(1) 100 μl 反應體系中加入終濃度為 100 nmoI/L 模板 DNA，100 nmol/L 大腸桿菌 RNA 聚合酶及緩沖液 A (或 T7 噬菌體聚合酶及緩沖液 F)，于 37℃ 孵育 5 min。
(2) 避光加入 100 μmol/L ATP，10 μmol/L UTP 或 CTP，20 μmol/L [ α-32P] GTP，150 μmol/L 5-APAS-UTP 或 5-APAS-CTP，以及加入濃度逐漸遞增的 UTP 或 CTP ( 0 μmol/L，1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L 孵育 5 min。
(3) 加 1 μl 肝素，于 37℃ 孵育 10 min。
(4) 加入RQ1 無 RNase 的 DNase I (5U) ，于 37℃ 孵育 10 min。
(5) 加入 100 mmol/L MgCl2，20 μg 無 RNase 的 tRNA。
(6) 加入等體積 (100 μl ) 酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1) ，振蕩混勻，14000 g 離心 5 min。
(7) 取上層水相至一新離心管，加入 3 倍體積（300 μl ) 的含 1 mol/L NH4Ac 的乙醇，混勻，冰浴 10 min，14000 g 離心 5 min。
(8) 小心去除上清，以 100 μl 80% (V/V) 乙醇洗 RNA，14000 g 離心 5 min。
(9) 小心去除上清，晾干。
(10) 將 RNA 溶于 100 μl 去離子水或緩沖液中。
(11) 將反應產物等分，取一半加入一干凈離心管，將管置于 UV ( 302 nm max) 光源 1.5 cm 處，室溫照射 2 mm，另一半反應產物在照射過程中置于室溫避光處。
(12) 加 100 mmol/L DTT 以還原殘余疊氮化合物，避光反應至少 5 min（以后操作不必再避光）。
(13) 加入等體積 2X 緩沖液 C；于 95°C 孵育 2 min；冰浴冷卻；7 mol/L 尿素/聚內烯 酰胺膠電泳（膠濃度及長度取決于待檢測 RNA 的大小，RNA 大小與膠濃度有以下對應關系：大于 100 nt，6%；30~100 nt，5%；小于 30 nt，25%)。
(14) 在壓片盒內依次鋪上濾紙，膠，保鮮膜，X線片，增感屏；-80℃ 放射自顯影過夜。
(15) 從放射自顯影結果分析最適 UTP 或 CTP 濃度。
(16) 按方法“RNA 與蛋白交聯”進行 RNA 蛋白質交聯。
2. 分子表面摻入具光交聯活性的核苷酸類似物的 RNA 合成
(1) 按方法“全長含核苷酸類似物的 RNA 合成”中的步驟（1）~（10）制備并純化插入 5-SH-UTP 或 5-SH-CTP 的 RNA，調 pH 7.0。
(2) 避光環境加入 APB（溶解于二甲基砜），終濃度 5 mmol/L。
(3) 室溫避光孵育 2 h。
(4) 制備 Sephadex G-50 柱：稱取 7 g Scphadex G-50，加 100 ml 去離子水，懸浮液高壓滅菌。將 1 ml 的 Sephadex G-50 懸浮液加入 1 ml 的柱內，3500 g 離心 3 min，重復上樣至柱內凝膠體積達 750 μl。
(5) 以 200 μl 緩沖液 D 平衡柱，3500 g 離心 4 min，重復 3 次，棄洗脫液。
(6) 避光加入 200 μl 反應液 [ 凝膠與樣本液之間的比例 ( 750：200 ) 十分關鍵 ]。
(7) 3000 g 離心 3 min。
(8) 收集流出液，按方法“RNA 與蛋白交聯” 進行 RNA-蛋白質交聯。
3. RNA 與蛋白交聯
(1) 在 RNA-蛋白質交聯中采用前面實驗優化得到的最佳 UTP 和 CTP 濃度，重復方法1 中的步驟 (1)~(9)，用滅菌的去離子水或適宜的緩沖液 (根據相應的 RNA 或蛋白決定）重懸 RNA，加入適宜濃度的可能與 RNA 結合的蛋白。
(2) 將反應產物等分，取一半加入一干凈離心管，將管置于 UV 光源 1.5 cm 處，室溫 (有些結合需要特定的反應溫度）照射 2 min，另一半反應產物在照射過程中置于室溫避光處作為陰性對照。
(3) 加入 DTT 至終濃度 100 mmol/L，避光放置至少 5 min（此后步驟不必再避光）。
(4) 從未受照射的樣本中取出少量樣品用于鑒定所用 RNA 長度的正確性。[ 見方法“全長含核苷酸類似物的 RNA 合成”中，步驟 (13) ]。
(5) 余下樣品加入等體積的 RNase T1 消化緩沖液及 10 U/μl RNase T1，于 37°C 孵育 10 min。
(6) 加入等體積的 2X 蛋白上樣緩沖液，94°C 加熱 2~3 min，變性 SDS-PAGE 電泳。
(7) 常規“三文治”法電轉移：500 mA，2 h。
(8) 取膜銀染至見到條帶（約 5 min），空氣下燥。
(9) X 射線片，-80°C 放射自顯影至交聯蛋白顯現 ( 對交聯效率低的蛋白可能需要數天）。
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