植物RNA提取實驗——直接研磨法

通過裂解液β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑PLANTaid幫助結合多糖多酚并通過離心去除，然后用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最后低鹽的RNase free     H₂O將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

新鮮植物組織

β-巰基乙醇乙醇蛋白液RW1漂洗液RW蒸餾水無菌水

研缽離心管離心機移液槍移液管收集管吸附柱水浴鍋

一、 新鮮植物組織稱重后取100 mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100 mg放入研缽）， 加入10體積（1 ml）RLT(請確定已加入β-巰基乙醇)和1體積（100 ul） PLANTaid 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。
 

二、將裂解物轉入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13 000 rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid，取450 ul 裂解物上清轉到一個新離心管。
 

三、加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

四、將混合物(每次小于700 ul，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm離心60秒，棄掉廢液。
 

五、加700 μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
 

如果DNA殘留明顯，可在加入RW1后室溫放置5分鐘后再離心。
 

六、加入500 ul漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW，重復一遍。
 

七、將吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
 

八、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12 000 rpm 離心1分鐘。
 

九、如果預期RNA產量>30 ug，加30-50 ul RNase free water重復步驟7， 合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
 

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高，分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15-30%，但是濃度要低，用戶根據需要選擇。

1.  所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13 000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
 

2. 需要自備乙醇，β-巰基乙醇，一次性注射器（可選），研缽。
 

3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
 

4. 植物組織裂解是否充分直接影響到RNA 提取的質量和產量，本試劑盒中提供的裂解液RLT，主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數植物組織的裂解，但有些植物組織（例如玉米的乳白色胚乳）或絲狀真菌，由于次級代謝產物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產生固化，導致RNA 無法提取，此時可以向我們索取另一種裂解液RLC，將解決該問題。
 

5. 關于DNA 的微量殘留
 

一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的EASYspin系列RNA提取產品，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大多數RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電泳EB染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大，如果要進行嚴格的mRNA表達量分析如熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：
 

1) 選用跨內含子的引物,以穿過mRNA中的連接區,這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。
 

2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。
 

3) 將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup)，請聯系我們索取具體操作說明書。
 

4) 在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進行DNase I處理。請聯系我們索取具體操作說明書。
 

6. RNA 純度及濃度檢測
 

完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5xTBE電泳緩沖液；150 v，15 分鐘)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應能看到非常明顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大小分別約為5 kb 和2 kb，分別相當于28S 和18S rRNA。動物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應為次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。
 

純度：OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 讀數（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD₂₆₀/OD₂₈₀ 讀數受測定所用溶液的pH 值影響。同一個RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD₂₆₀/OD₂₈₀ 讀數1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
 

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計調零，取稀釋液進行OD₂₆₀，OD₂₈₀ 測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度（ng/μl）= (OD₂₆₀)x(稀釋倍數n)x40

RNA 純度及濃度檢測

完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150 v，15 分鐘)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應能看到非常明顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大小分別約為5 kb 和2 kb，分別相當于28S 和18S rRNA。動物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應為次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的RNA，OD260/OD280 讀數（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數受測定所用溶液的pH 值影響。同一個RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計調零，取稀釋液進行OD260，OD280 測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數n)×40