隨著體外分子實驗技術的發展，近年來相繼發現了許多具有不同催化功能的 DNA 分子，這些被稱為脫氧核酶的催化型 DNA 分子可以催化切割反應、連接反應、卟啉環金屬化等許多化學反應，而且還具有 DNA 激酶活性。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 隨著體外分子實驗技術的發展，近年來相繼發現了許多具有不同催化功能的 DNA 分子，這些被稱為脫氧核酶的催化型 DNA 分子可以催化切割反應、連接反應、卟啉環金屬化等許多化學反應，而且還具有 DNA 激酶活性。 |
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| 實驗材料 | 脫氧核酶 |
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| 試劑、試劑盒 | 脫氧核酶切割緩沖液終止緩沖液脂質體 |
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| 儀器、耗材 | 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置放射自顯影用具水浴 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。
2. 放射自顯影用具。
3. 水浴。
4. 脫氧核酶 ( 修飾或未修飾）由化學合成獲得。
5. 脫氧核酶體外切割的底物 RNA 由體外轉錄獲得。
6. 2X 脫氧核酶切割緩沖液：50 mmol/L Tris ( pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，0.01% SDS。
7. 終止緩沖液：95% 去離子甲酰胺，0.05% 溴酚藍，0.05% 二甲苯青，10 mmol/L EDTA。
8. 脂質體。
二、操作方法
1. “10-23” 型脫氧核酶的設計
(1) 采用 RNA 二級結構分析軟件對靶 RNA 進行二級結構模擬分析，選擇主環、單鏈凸出區作為首選切割位點。雖然目前使用的二級結構預測軟件的準確性還有待于提高，但是其預測結果仍可以作為選擇靶位點和設計脫氧核酶的參考。
(2) 選擇切割反應發生在 RNA 分子的嘌呤（G 或 A ) 與嘧啶 ( U 或C ) 之間，一般多將起始密碼子 AUG 作為首選候選切割點之一。
(3) 對于長鏈 RNA 底物，既要考慮脫氧核酶臂的長度，又要考慮脫氧核酶底物結合的穩定性。通常脫氧核酶的臂長為 7~9 個核苷酸，臂過短時核酶與底物結合不穩定，不利于核酶與底物的結合；臂過長時則結合過于牢固，不利于核酶與切割產物的分離，同樣影響酶效率。當然，在考慮核臂長的同時，還要考慮核酶的堿基組成。
(4) 應用在細胞內部的脫氧核酶，可以對其臂兩端的幾個核苷酸進行硫代修飾或甲氧基修飾以提高脫氧核酶在細胞內的穩定性。
(5) 一般需要設計 3~8 條候選脫氧核酶進行實驗篩選。
(6) 目前發展了一些篩選可接近位點的方法，也可以針對獲得的 RNA 可接近位點設計脫氧核酶以提高設計的準確性（參見反義核酸技術）。
2. “10-23” 型脫氧核酶體外切割活性的驗證
(1) 脫氧核酶切割底物 RNA 反應體系。取 0.5 nmol/L~0.5 μmol/L 脫氧核酶和 0.2 μmol/L 底物分別加入等體積的 2X 脫氧核切割緩沖液，于 37℃ 溫育 10 min 后再將兩者混合，于 37℃ 溫育 1 h。
(2) 加入終止緩沖液結束反應，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析脫氧核酶的切割活性。
(3) 銀染或放射自顯影（如果 RNA 底物用放射性同位素標記）。
3. “10-23” 型脫氧核酶體內抑制靶 RNA 基因表達活性的驗證
(1) 轉染細胞。將無菌的脫氧核酶直接加入細胞培養瓶中，濃度一般為 2~20 μmol/L；如果使用脂質體轉染細胞，脫氧核酶的濃度可以降至 0.1~1 μmol/L。設置陰性對照。
(2) 培養 48~72 h 后收集細胞。
(3) 提取 RNA，然后采用 RT-PCR 或 Northern blot 方法檢測靶 RNA 的抑制情況。
(4) 裂解細胞，提取蛋白質，采用 Western blot 方法檢測靶 mRMA 表達的蛋白質水平的變化。 |
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