肽中磷酸化氨基酸位置測定實驗

洗脫的磷酸肽（見輔助方案 1）

5%(V／V)異硫氰酸苯酯(PLTC)溶于吡啶中10:1(V／V)庚烷／乙酸乙酯-10 份庚烷與 1 份乙酸乙酯混合2:1(V／V)庚烷／乙酸乙酯-2 份庚烷與 1 份乙酸乙酯混合100%(m V)三氟乙酸(TFA) 電泳緩沖液(pH 1.9 200~500 cpm 32P（用去離子水稀釋 32P 正磷酸鹽配制)或 2 mg／ml PTH-磷酸酪氨酸

微量離心管45℃ 水浴適用于契侖科夫計數法的閃爍計數器TLC 平板(20 cm × 20 cm 100 μm 纖維素)65℃ 烘箱或風扇

1. 根據候選肽段的列表確定循環數。

將循環數指定為^每一循環的起始體積為 20 μl。

2. 在稱為反應管（微量離心管）的管子中將洗脫的肽溶解于 20 μl 去離子水中。

3. 取 20/（x+1）μl 的一份樣品到一新的管子中；此為起始樣品材料，儲存于 4℃。

4. 補加去離子水到反應管中，使總體積恢復到 20 μl。此時開始對樣品進行計數：

4.1 確保從起始樣品中實際取出所需的 cpm 量（作為起始樣品材料）；

4.2 在每一循環開始時檢測 cpm。

5. 每個反應管中加入 20 μl 5%（V/V）異硫氰酸苯酯（溶于吡啶中），充分渦旋振蕩混勻，短暫離心收集液體至管底，45℃ 孵育 30 min。

6. 每個反應管中加入 200 μl 10:1 庚烷/乙酸乙酯，渦旋振蕩 15 s。全速離心 1 min 分離兩相。

吡啶會進入有機相（上層）。

7. 用帶塑料吸頭的移液器，小心吸去上層有機相。按步驟 6 的方法用 10:1 庚院/乙酸 乙酯再次抽提水相（下層）。

8. 按步驟 6 的方法用 2:1 庚烷/乙酸乙酯抽提水相 2 次。

9. 在干冰上冷凍水相，然后在 SpeedVac 蒸發器中凍干。

10. 將干的樣品重新溶解于 50 μl 100% 三氟乙酸（TFA），45℃ 孵育 10 min。

11. 在 SpeedVac 蒸發器中凍干樣品。

12. 用契侖科夫計數法對樣品計數。

測得的 cpm 應當與循環開始時的值（即步驟 4）相同。

13. 往反應管中加入 20μl 去離子水，渦旋振蕩，短暫離心。取出 20/x μl 第一個循環的產物用于分析。取出的樣品與起始樣品一起儲存于 4℃。

14. 補加去離子水到反應管中，使總體積恢復到 20μl，開始第二輪反應。重復步驟 5~12。

15. 第二輪反應后，加 20μl 去離子水重懸剩余的樣品，取出 20/（x -1）μl 轉移到新的管中作為第二輪產物以待分析。重復步驟 4~12。

16. 繼續重復步驟 4~12 的操作，直至進行到所需的反應輪數。

對于每一新的循環，所取的樣品量為 2（x-y）μl，此處 y 等于循環輪數減去 1。

17. 將所有樣品在 SpeedVac 蒸發器中凍干。用契侖科夫計數法對所有的最終樣品進行計數。

18. 如果進行了凍干，用 5μl pH 1.9 的電泳緩沖液或去離子水溶解樣品。以最大速度離心 2 min 以沉淀不溶的物質。

如果每輪反應后所取樣品的體積很少，可以跳過步驟 17 和 18，將樣品直接上樣到 TLC 平板上。

19. 將分析一個既定的磷酸肽的所有樣品以至少 1 cm 的間距點樣于 TLC 平板中心的一條垂直線上的起始點（見圖 17.9.5）。將 50~200 cpm [32P] 磷酸鹽或 1~2 μg PTH-磷酸酪氨酸（0.5~1.0 μl 2 mg/ml PTH-憐酸酪氨酸儲液）（取決于所研究的 肽的磷酸氨基酸的組成）作為標記點樣于位于同一垂直線上的起始點。點樣時每次滴加 1/3~1/2 μl 樣品，干燥后再滴加下一滴（見基本方案 1 步驟 25）。

20. 如圖 17.9.5，浸濕平板。

21. 準備 HTLE7000 裝置，以 1.0 kV 電壓在 pH 1.9 的電泳緩沖液中電泳 25 min（見基本方案 1 和圖 17.9.3）。

22. 待平板干燥后（用 65℃ 烘箱或風扇），用放射性或熒光標記物進行標記，在增感屏 的輔助下于 -70℃ 對預敏化的膠片曝光（放射自顯影）。