NSMB背靠背丨黃志偉揭示其抑制typeV型Cas12a活性的新機制

　　CRISPR-Cas適應性免疫系統為細菌和古細菌對抗噬菌體和質粒入侵提供了核酸序列特異性的防御機制【1】。CRISPR-Cas系統分為6個亞型，其中II型CRISPR-Cas9和V 型CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統被廣泛應用于基因組編輯和多種多樣的生物技術應用【2,3】。在噬菌體感染細菌過程中，細菌的Cas效應蛋白Cas9或Cas12a在RNA指導下通過PAM-interacting (PI)結構域識別位于靶向雙鏈DNA（dsDNA）的PAM序列并解旋靶向dsDNA的兩條鏈，從而guide RNA與DNA的靶向鏈形成異源雙鏈結合，然后Cas12a核酸酶結構域切割靶向dsDNA的兩條鏈，從而抵御噬菌體的入侵。作為對CRISPR-Cas免疫系統的反應，噬菌體進化出CRISPR-Cas的蛋白抑制因子anti-CRISPR蛋白，使噬菌體能夠逃逸細菌CRISPR-Cas防御系統。

　　4月1日，哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授課題組研究在Nature Structural & Molecular Biology雜志上發表了題為An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation的研究成果，發現了新型Anti-CRISPR蛋白，并揭示其抑制type V型Cas12a活性的新機制。

　　研究者首先通過生物信息學方法尋找到一類anti-CRISPR候選蛋白,接著通過生化和細菌實驗發現其中的一個anti-CRISPR蛋白AcrVA5具有抑制Moraxella bovoculi (Mb) Cas12a活性的能力，但是意外的是凝膠遷移實驗發現AcrVA5蛋白并不結合MbCas12a-crRNA，這個現象與以前研究發現的anti-CRISPR蛋白通過結合Cas蛋白阻止靶向DNA的結合或者阻止Cas蛋白核酸內切酶活性完全不一樣，推測MbCas12a的抑制活性可能是通過一種未知的酶修飾而實現的。接著通過對AcrVA5蛋白序列分析以及進一步生化實驗揭示AcrVA5蛋白具有乙酰基轉移酶活性，進一步的生化實驗證實AcrVA5蛋白通過乙酰化修飾MbCas12a蛋白使其失去切割DNA的能力。

　　接下來尋找AcrVA5在MbCas12a蛋白上的乙酰化修飾位點。這類乙酰基轉移酶通常修飾底物蛋白上的賴氨酸（K）殘基，由于K635是MbCas12a識別底物DNA的PAM序列的關鍵氨基酸，因此推測MbCas12a的K635可能是AcrVA5乙酰化修飾從而失活的關鍵位點。接著MbCas12a的K635R突變試驗證實該突變體活性不能被AcrVA5抑制，同時發現AcrVA5對另一Mb strain (Mb2)的Cas12a（識別PAM序列的關鍵氨基酸是精氨酸而不是賴氨酸）沒有抑制能力，表明AcrVA5蛋白發揮其抑制作用主要依靠乙酰化Cas12a蛋白PAM識別區域的K殘基發揮作用的。有趣的是，Mb2Cas12a的R625K突變體的活性能夠完全被AcrVA5抑制，從而該結果結合質譜分析證實AcrVA5蛋白通過修飾MbCas12a蛋白的識別底物PAM的關鍵K635殘基使之失活。

　　Cas12a蛋白的結構揭示K635的乙酰化不僅使dT2和dA(3*)之間失去氫鍵相互作用，也可能與臨近的PAM DNA形成空間位阻，阻止了dsDNA的結合，從而使Cas12a失去dsDNA切割活性。

　　該研究揭示的anti-CRISPR通過乙酰轉移酶活性修飾并抑制CRISPR蛋白的機制和該課題組以前發現的anti-Cas9的抑制機制完全不一樣，anti-Cas9是通過直接結合Cas9的底物結合位點從而抑制Cas9的活性。因此該研究首次揭示了anti-CRISPR蛋白通過酶修飾作用抑制細菌CRISPR-Cas免疫防御系統的新機制和策略，也為噬菌體和細菌免疫系統（CRISPR-Cas）之間的進攻防御策略提供了新觀點。該發現可以用于在體內精確控制Cas12a的活性，提高基因編輯的精確性。這也是該團隊在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機制研究領域取得的又一重要研究成果。

圖片引自NSMB雜志News & Views部分

　　據悉，黃志偉教授為該研究論文的通訊作者，博士研究生董立永和關曉宇，北京大學高寧組的李寧寧博士為該論文的并列第一作者。上海同步輻射中心為晶體數據收集提供了支持。

　　在同期雜志上，加州大學Jennifer Doudna發表了題為Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a的研究論文，揭示了AcrVA1, AcrVA4 and AcrVA5三種抑制因子可通過不同的機制抑制Cas12a的活性，即AcrVA1可通過觸發切割Cas12a結合的guide RNA的目標識別序列，從而不可逆地失活Cas12a復合物；AcrVA5可抑制dsDNA的識別；AcrVA4除可抑制dsDNA的識別還可引起Cas12a的二聚化。

　　另外值得一提的是，NSMB的News & Views欄目同時對這兩項研究進行了點評，指出這兩項研究揭示了type V Acr蛋白可以利用酶活性關閉Cas12a的內切功能，將有利于更好的利用CRISPR技術。

　　事實上，兩篇背靠背的工作實際上黃志偉課題組的工作較Jennifer Doudna研究組更勝一籌，Doudna研究組雖然找到了關鍵蛋白但是實際上并沒有發現具體的機制（詳見下圖Doudna研究組論文中的示意圖，右下角部分用？代替）。實際上，AcrVA5蛋白發揮其抑制作用主要依靠乙酰化Cas12a蛋白PAM識別區域的K殘基發揮作用的。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41594-019-0206-1

　　https://doi.org/10.1038/s41594-019-0208-z

　　參考文獻

　　1. Marraffini, L. A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526, 55–61 (2015).

　　2. Shalem, O. et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84–87 (2014).

　　3. Zetsche, B. et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat. Biotechnol. 35, 31–34 (2017).