一、材料準備
1. 細胞系培養條件：高糖DMEM，10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），37℃，5%CO2，孵箱培養。
2. 人宮頸癌上皮細胞培養條件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5% CO2孵箱培養。
二、實驗步驟
1. 雜交體Tec ORF的獲得
（1）人Tec與大鼠、小鼠Tec具有高度同源性 。由于人Tec ORF編碼框上游引物退火溫度較低，不宜直接PCR從文庫中調取，故采取兩步法，首先用小鼠Tec 5‘引物與人的Tec 3 引物在大鼠文庫中擴的雜交體Tec讀碼框。
（2）引物：上游：5 ’ATG ATG GTG TCA TTC CCT GTC AAA-3’，下游：5 -GC TCT AGA TCT TCC AAA AGT TTC TTC ACA-3’，模板：大鼠cDNA文庫。
（3）PCR體系25 ul，退火溫度42℃，5個循環，再提高退火溫度至48℃ ，反應28個循環。
（4）PCR產物經1%瓊脂糖電泳發現一條1.8 kb 左右片段，回收酶切后連入PMD-T載體，小規模細菌擴增后隨機挑取20個菌落，用PCR法與酶切法篩選陽性克隆，再經測序比對序列。
2. 人Tec真核表達載體的構建經測序證實雜
（1）交體Tec ORF與人Tec ORF在5 端相差一個堿基，進而合成一條新5 引物：5’ATG ATG GTG TCA TTCCCT GTC AAlA-3‘；下游引物仍為人Tee含Xba 1酶切位點的下游引物。
（2）以雜交體T為模板。退火溫度52℃，5個循環，再提高退火溫度至58 ℃，反應28個循環。
（3）1%瓊脂糖電泳發現1.8 kb 左右片斷．收酶切后用T4 DNA連接酶連接于pc-DNA 3.1真核表達載體。
（4）連接產物做小規模細菌轉化，PCR及酶切鑒定后經測序證實。
3. pCDNA3.1瞬時轉染細胞
（1）Hela細胞1×106接種于90 mm 平板，待貼壁后長至70% 密度時進行轉染pCDNA3.1質粒10 ug、脂質體12 ul 與無血清DMEM混勻后輕覆細胞。
（2）轉染10 h 后換含10%FBS的DMEM培養至48 h。
（3）加入RIPA（97.5%PBS、1% NP 40、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1%SDS）冰上裂解30 min。
（4）4℃ 離心取上清，提取總蛋白（10 g/組） 經10% SDS—PAGE膠分離。
（5）電轉（100 mA、120 min）至PVDF膜上。
（6）膜用TBST中封閉，3 h 后置于含抗Tec抗體（1：1 000）的TBST中室溫孵育1 h，再加人相應結臺的二抗后與ECL發光檢測劑結合顯示結果。
展開 | 