| 實驗方法原理 | 粗糙脈胞菌的菌株具有兩種不同的接合型(matingtype),用A、a或mt+、mt-表示。接合型是由一對等位基因控制的,并符合孟德爾分離定律。不同接合型菌株的細胞接合后可以進行有性生殖。在有性生殖過程中,不同接合型的菌絲相接觸,兩核配對,但不融合,形成雙核體,隨著雙核體菌絲的發育,子囊殼中形成很多伸長的囊狀孢子囊,即子囊進行發育。在這些尚未成熟的子囊中即含有融合以后形成的二倍體合子。合子形成以后就很快在發育的子囊中進行減數分裂,形成4個孢子,再進行一次有絲分裂,形成8個單倍體的子囊孢子,而整個子囊殼就成為成熟的子囊果(圖21-1)
粗糙脈胞菌的子囊孢子是單倍體,即它們是減數分裂的產物,由它萌發長出的菌絲也是單倍體。所以一對等位基因決定的性狀在雜交子代中就可以看到分離。在粗糙脈胞菌中,一次減數分裂產物包含在一個子囊中,所以從一個子囊中的子囊孢子的性狀特征就很容易直觀地看到一次減數分裂所產生的四分體中一對等位基因的分離。而且8個子囊孢子是順序排列在狹長形的子囊中,根據這一特征可以進行著絲粒作圖,并發現基因轉換(geneconversion)。如果兩個親代菌株有某一遺傳性狀的差異,那么雜交所形成的每一子囊,必定有4個子囊孢子屬于一種類型,4個子囊孢子屬于另一種類型,其分離比為1∶1,且子囊孢子按一定順序排列。如果這一對等位基因與子囊孢子的顏色或形狀有關,那么在顯微鏡下可以直接觀察到子囊孢子的不同排列方式(圖21-2)。
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| 實驗材料 | 粗糙脈胞菌野生型菌株：Lys + 接合型 A 分生孢子呈粉紅色粗糙脈胞菌賴氨酸缺陷型菌株：Lys - 接合型 a 分生孢子呈白色。 |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 雜交接種:將親本菌株接種在同一雜交培養基上。先接缺陷型,后接野生型,一次在雜交培養基上接種兩親本菌株的分生孢子或菌絲。然后在培養基上放入一滅菌的折疊濾紙,在試管上貼上標簽,注明親本、雜交日期及實驗者姓名。 2. 培養:將試管放入25℃溫箱進行培養。5～7d后就能看到許多棕色原子囊果出現,隨后逐漸發育成熟,變大變黑,約21d(3周),就可在顯微鏡下觀察。需要注意的是,賴氨酸缺陷型的子囊孢子成熟較遲,當野生型的子囊孢子已成熟變黑時,缺陷型的子囊孢子還呈灰色,因而我們能在顯微鏡下直接觀察不同的子囊類型。如果觀察時間選擇不當就不能觀察到好的結果。觀察時間過早,孢子都未成熟,全為灰色;過遲都成熟了,全為黑色,都不能分清子囊類型。所以最好在子囊果發育至成熟大小,子囊殼開始變黑時,每日取幾個子囊果壓片觀察,到合適時期置于4～5℃冰箱條件下,保證在3～4周內觀察就行。 3. 壓片觀察:將附有子囊果的濾紙條放入3%來蘇爾溶液10min,殺死孢子,以防止污染實驗室。取一載玻片,滴1～2滴3%來蘇爾溶液,然后用接種針挑出子囊果放在載玻片上,蓋上另一載玻片,用手指壓片,將子囊果壓破,置顯微鏡低倍鏡下觀察,即可見一個子囊果中會散出30～40個子囊。觀察子囊孢子的排列情況。這里用載玻片蓋上壓片而不用蓋玻片,是因為子囊果很硬,蓋玻片易破裂。此過程不需無菌操作,但要注意不能使分生孢子散出,以致不能分辨子囊類型。觀察過的載玻片,用過的鑷子和解剖針等物都需放入來蘇爾溶液中浸泡后取出洗凈,以防止污染實驗室。 |
