質粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉化

實驗概要

本實驗從轉化農桿菌中大量提取質粒DNA并純化，利用離體子房注射法將外源基因導入棉花，獲得轉基因棉花。

主要試劑

1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]

2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]

3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混勻)

4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)

5. 異丙醇

6. 4 mol/L LiCI

7. RNase

8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿

9. 乙醇

主要設備

1. 搖床

2. 制冰機

3. 高速離心機

4. 水浴鍋

5. 超凈工作臺

6. 玻璃毛細管

7. 微量注射器

實驗材料

棉花，轉化農桿菌菌株

實驗步驟

1. 37℃, 250 rpm搖菌500 ml。

2. 5000 × g離心5 min以收集菌體，用50 ml STE洗滌菌體一次。

3. 加入溶液I 20 ml懸浮菌體。

4. 加溶液II40 ml，輕輕將離心管顛倒幾次，置冰浴20 min。

5. 加預冷的溶液III30 ml，將離心管顛倒幾次，置冰浴10 min以上。

6. 10000 × g離心15 mm，取上清液加入0.6倍體積的的異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min以上。

7. 10000 × g離心10 min，棄上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI，混勻后室溫放置10 min以上。

8. 10000 × g離心5 min，取上清液加入RNase至終濃度為100 ug/ml，37℃保溫2h。

9. 用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍體積的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍體積的無水乙醇。

10. 離心收集DNA沉淀，70%乙醇洗滌一次。干燥后溶于TE中備用。

11. 棉花的遺傳轉化:大量的質粒，用無菌水稀釋成2 mg/ml的DNA溶液進行子房注射。注射在超凈工作臺上進行，注射針是玻璃毛細管，頂端直徑約為0.1mm。將毛細管另一端緊緊套入10-20ul的微量注射器針頭，吸取被注射的DNA樣品6-12ul。注射時，將針頭對準子房伸出的花絲部分進行。每個子房約注射0.2ulDNA。