小鼠精原細胞的分離和純化

【摘要】　目的　探討小鼠精原細胞的分離純化。　方法　用組合酶消化法制備7～8d小鼠的生殖細胞懸液；用Percoll不連續密度梯度法分離精原細胞。　結果　所獲細胞懸液內活細胞、死細胞及細胞團的百分比分別為90.08%、9.92%及8.91%；平均每個睪丸可獲得4.136×10⁵個細胞；精原細胞主要分布于位于27%～35%間的Percoll梯度中，其超微結構與7～8d小鼠睪丸切片內精原細胞的超微結構一致，經純化后其純度達68.76%。　結論　用組合酶消化、Percoll不連續密度梯度法分離的7～8d小鼠的精原細胞能滿足體外培養的需要。
　　【關鍵詞】　精原細胞；分離；小鼠
　　【中圖分類號】　S865.1⁺30.1　【文獻標識碼】　A　【文章編號】　0529-1356(2000)03-235

SEPARATION AND PURIFICATION OF SPERMATOGONIA IN MOUSE

ZHANG Xue-ming, LAI Liang-xue, LI De-xue^?, LI Zi-yi, WEN Xing-hao，
DU Xi-ming, YUE Zhang-peng, WANG Yan-zhao
(Department of Histology and Embryology, Faculty of Animal Sciences and Technology,
Quarter-master University of PLA, Changchun　130062,China)

　　【Abstract】　Objective　　To study separation method of mouse spermatogonia by Percoll discontinue density gradient centrifugation. Methods　Combination of enzymatic digestion was used to prepare germ cell suspension of mouse at 7-8 days and Percoll discontinue density gradient centrifugation was used to isolate spermatogonia. Results　Percentage of living cells, dead cells,clumps in suspension was 90.08%, 9.92%, 8.91% respectively, and 4.136×10⁵ cells could be obtained from one testis in average. Spermatogonia were mainly distributed in Percoll gradient between 27%-35%. Their ultrastructure was consistent with that in testis sections of 7-8 day old mouse. Purity of spermatogonia was 68.76% after they were purified. Conclusion　Spermatogonia isolated from mouse at 7-8 days by combination of enzymatic digestion and Percoll discontinue density gradient centrifugation could satisfy the needs of culture.
　　【Key words】　Spermtogonia; Separation; Mouse

　　精原細胞的生理生化特性及其分裂增殖、分化、運動、衰老、死亡等項生命活動的調節機制的深入研究，精子發生機理的進一步闡明以及精原細胞異體、異種移植技術的實際應用，都迫切需要找到一種可行的方法將其分離純化，以期得到較高產量和純度的有活力的精原細胞，用于體外培養。資料表明，從成年嚙齒類的睪丸分離粗線期及其后各發育階段生精細胞的工作已取得可喜成績，所獲細胞的純度已超過90%，產量達到10⁷個^［1］。但可用于體外培養的精原細胞的分離卻一直進展不大。有些報道雖然純度很高，產量卻很低；另一些報道產量高但純度低。1977年，Bellve等^［2］報道從生后8d小鼠睪丸中獲得了純度91%的A型精原細胞，產量達2×10⁷個。但使用的小鼠卻多達60余只，耗費了大量的實驗動物。我們的前期工作已表明，小鼠生后7～8d，其生精上皮內基本只有支持細胞和A型精原細胞，其他各級生精細胞尚未發育形成^［3］。在體外，支持細胞總是先生殖細胞而貼壁。因此，本實驗選用生后7～8d小鼠的睪丸，事先排除其他生精細胞的污染，用組合酶消化獲得細胞懸液，經Percoll不連續密度梯度離心，再用選擇性貼壁法純化，獲得了較高純度的精原細胞，基本滿足了體外培養的需要。

材料和方法

1.實驗動物
　　昆明小白鼠由本校實驗動物中心提供，按常規方法飼養管理。參照文獻［3］取7～8d小鼠用于細胞分離。
2.主要試劑
　　膠原酶IV(Sigma)，透明質酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，D-MEM(Gibco)，新生牛血清(NBS，Gibco)，Percoll(Pharmacia),胎牛血清(FBS，Gibco)。
3.細胞的分離
　3.1　分離液的配制：按PBS∶Percoll=1∶9的比例把濕熱滅菌后的Percoll原液配制成90%的Percoll溶液。用無鈣、鎂離子PBS，按表1所列方案配制Percoll各梯度溶液。

表1　Percoll密度梯度的濃度、組成及密度
Table 1　Concentration, components and
density of Percoll gradients

3.2　細胞懸液的制備：取7～8d雄性小鼠5～6只，頸椎脫臼法處死。無菌收集兩側睪丸，置于盛有PBS的小皿中。整個睪丸收集過程在0.5h內完成。用尖鑷子仔細去除每個睪丸的脂肪墊、附睪及睪丸白膜，加入適量PBS(1～2ml)，吸管用力吹打，將曲細精管吹散。加入相當于組織體積10倍的含1g/L膠原酶的PBS后入溫箱，在37℃、5%CO2條件下作用15min(期間晃動數次)。之后移入5ml的離心管，輕緩吹打1～2次，靜置待曲細精管段沉降后輕輕吸除上清，再重復上述過程1次。加入含1.5g/L透明質酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入溫箱，同樣條件下作用5～10min，倒置顯微鏡下見曲細精管段軟散，有的已消散成單細胞或小的細胞團即可。加入含10%NBS、1%青、鏈霉素的新鮮D-MEM培養液終止消化，移入離心管中，1 000r/min離心3min或靜置5min，待軟散的曲細精管及已解離的精原細胞沉降后，輕輕吸去上清。重新加入1.5ml新鮮培養基(D-MEM+7.5%NBS+7.5%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%青、鏈霉素+1%丙酮酸鈉)，吹打8～10次，制成單細胞懸液。 　3.3　Percoll梯度的制備及離心：從已制備好的每級Percoll梯度液中各取1ml，按密度從大到小依次疊加到10ml離心管中。將待分離的細胞懸液置于梯度最上層，以1 400r/min離心20min［4］。 　3.4　細胞的洗滌及計數：用吸管將各梯度中形成的細胞帶小心取出，移至事先標記好的5ml離心管中，各加入1.5ml PBS稀釋Percoll，以1 000r/min的速度離心3min,棄上清，重新加入1.5ml新鮮培養液吹起。取出1滴制備好的細胞懸液，加入10μl 0.4%臺盼藍混勻，用紅細胞計數板計算活細胞、死細胞、細胞團的數目和細胞總數(沒有吹散的由2個以上細胞連在一起的細胞團只記1次)，調整細胞密度至3×105個／ml。 　3.5　細胞的接種和培養　參照文獻［3］進行。 　3.6　精原細胞的純化及其純度評估：分離細胞接種后，定時觀察貼壁情況。當見到混雜其中的睪丸體細胞開始貼壁時，小心傾斜培養皿，將尚未貼壁的精原細胞連同培養液一起吸出，另行接種培養。待細胞貼壁后(大約培養12～24h)，棄去舊液，用PBS洗1～2次，加入新鮮培養液。任選3個視野，用計數器計每個視野中的細胞總數和精原細胞數(圓形的精原細胞附著在多突起的支持細胞上，呈鏈狀、葡萄串狀或以散在方式存在［3］)，然后分別計算均值±標準差(±s)。 4.電鏡樣品的制備 　　將新分離后位于27%～35% Percoll梯度間的細胞離心成團，棄去培養液，加入2ml 2.5%戊二醛，4℃下預固定24h；PBS清洗后轉至1%的鋨酸中后固定2h，逐級丙酮脫水，Epon812包埋，超薄切片機切片，JEM-1 200EX　Ⅱ電鏡觀察(分布在19%～27%及35%～43%Percoll梯度間的細胞太少，沒有制成電鏡樣品)。 5.統計學分析 　　表2用方差分析法(analysis of variance)、表4用χ2檢驗法(Chi-square test)對所得數據進行統計學處理。