花粉管的胞吞胞吐速率和囊泡運輸速度的研究

實驗概要

本實驗從植物花粉管的生長速度，花粉管的超微結構著手，用近似的模型結合幾何學手段研究青杄和雪松花粉管的胞吞與胞吐速率,并用全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM) 觀測其花粉管中分泌小泡的移動速度等。

主要試劑

1. 蔗糖、氯化鈣和硼酸均用雙蒸水溶解，然后按照所需濃度配制。

2. FM4-64的配制：5 mg的FM4-64 (分子量為607.5，購于Sigma)溶于2.5 mL的DMSO中，配成濃度為2.5 mg/mL (3.3 mM)的儲存液，置于-20 ℃，用之前再用重蒸水進行稀釋。

主要設備

JEM-1230電子顯微鏡 (JEOL Ltd. Tokyo，Japan)

實驗材料

青杄、雪松花粉散粉之前采集成熟的孢子置于室溫，過夜，待散粉后，用無菌干燥小瓶收集花粉，于-20℃保存備用。

實驗步驟

1. 花粉培養

花粉于100%濕度的容器室溫水合30 min后，以1 mg mL^-1的濃度接種于液體培養基中。青杄、雪松花粉培養基含有12% 蔗糖，0.01% H₃BO₃，0.03% CaCl₂。所有樣品置搖床 (125 rpm )中，24℃恒溫培養。

2. 花粉管生長速率的測定

青杄和雪松花粉分別離體培養15小時和36小時，每隔6小時取樣。樣品在Zeiss顯微鏡 (Axioskop 40)下選取已萌發的花粉進行拍照，以軟件Axiovision測量花粉管的長度，每個樣品至少測定300個花粉管，計算出平均長度和標準差。

3. 電鏡觀察

用2.5%的戊二醛和4%的多聚甲醛  (0.1 M的磷酸緩沖液pH 7.2配制，另加2%蔗糖)  固定材料，抽氣，固定時間為3-4小時。然后用相同的緩沖液沖洗3次，而后再用1%鋨酸進行后固定，固定時間為1-2小時。樣品用系列乙醇沖洗，Spurr樹脂包埋，60  ℃聚合16小時。用LKB-V切片機切片，經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染后，在JEM-1230電子顯微鏡下觀察、拍照。

   1) 0.2M的不同pH值磷酸緩沖液的配制：

原液Ⅰ：將2.76克NaH₂PO₄·H₂O或3.12克NaH₂PO₄·2H₂O溶于100 mL蒸餾水中。

原液Ⅱ：將3.56克NaHPO₄·2H₂O或5.36克Na₂HPO₄·7H₂O或7.16克Na₂HPO₄·12H₂O溶于100 mL蒸餾水中。

將Ⅰ和Ⅱ依下表比例混合配制成不同pH值的PBS緩沖液。

   2) 8%多聚甲醛的配制:稱取0.8 g的多聚甲醛，加入10 mL 重蒸水，60 ℃水浴加熱，直到幾乎完全溶解，需要放置2-3小時才能使用，所以要提前配制。

   3)  醋酸雙氧鈾染液配制：50%或70%酒精配制1-2%的醋酸雙氧鈾飽和液。遮光保存，下面有沉淀。有一定輻射性，但很弱，對人體影響不大。染色時，培養皿底部放置濕的濾紙，以防染液失水。染后，在3杯重蒸水中順塑料條方向洗0.5-1分鐘。染40分鐘左右，中間加少量沖蒸水。

   4) 檬酸鉛染液配制： 0.1g NaOH(0.1M)溶于25 mL 重蒸水中，然后再溶入0.125 g檸檬酸鉛，0.5% (容器30 mL即可，太大空間含CO₂，易形成沉淀)，(輕)振蕩、溶解、靜置。染色時，現配現用，用時取中間部分。染時在大培養皿中放入NaOH，染30分鐘左右。

   5) 鋨酸母液 (4%):  先將盛有1克鋨酸的小瓶用洗衣粉洗干凈，然后用雙蒸水沖洗兩次，放在干凈的燒杯后置于冰箱中干燥。干燥后將盛有鋨酸的小瓶放在50  mL棕色試劑瓶中，在通風柜內用玻棒打碎，加入25 mL雙蒸水，加蓋并密封，置于搖床上振蕩過夜后，在4℃下保存備用。

4. 花粉管中囊泡運送速度的觀測

   1) FM4-64的裝載: 方法參照Parton 等 (2001)，但略有改動。本實驗中最終的FM4-64使用濃度為3  μM。FM4-64儲存液用正常培養基稀釋10倍。然后把培養20 h的青扦花粉管取100 μL至eppendorf管內，取1  μL稀釋后的FM4-64加入100 μL的花粉管懸浮液內，使FM4-64的最終濃度為3 μM。

   2) 全內反射熒光顯微鏡觀測：全內反射熒光顯微鏡是在倒置顯微鏡 (IX81;  Olympus)的基礎上構建的。多通道氬離子激光發射器發出的光(458, 488, 515 nm; 30 mW)  通過單模塊光纖維和三組照明鏡頭聚焦在高孔徑物鏡(Apo 1003 OHR; NA 1.65;  Olympus)的背面，從而產生隱失波，允許樣品表層的熒光被激發。FM4-64的激發波長為514 nm。熒光通過100倍油鏡，530~600  nm濾光片，由電耦合CCD (Micromax, MMX-512-BFT; Princeton Instruments) 以200 ms/  幀的速度收集time-lapse圖像序列。

5. 數據分析

   1)  胞吞胞吐的計算：將花粉管看成是圓柱形，其頂端是半球體，將花粉管的生長可看成是一種勻速的生長。設定除了纖維素外，所有壁體積的增加都完全來自于胞吐小泡所攜帶的物質。這些物質在壁上沉積并不改變其體積，只是改變了形狀。因此采用Image  J 1.34e (Wayne Rasband, National Institutes of  Health)測出超薄切片下的花粉管的為花粉管壁厚度w，花粉管內徑D，胞吐小泡的直徑d等數據，根據單位時間內增加的細胞壁體積等于單位時間內的胞吐體積：

dV_cellwall = N_exo V_exo (N_exo為單位時間內胞吐小泡的數量；V_exo為胞吐小泡的體積)。

V_exo可通過小泡的直徑來計算：

V_{exo =}p d³_exo / 6 (d為胞吐小泡的直徑)。

單位時間內增加的細胞壁體積為：

dV_cellwall = [p( D   2w )² - pD²] v/4 =pw( D   w ) v (w為花粉管壁厚度)

所以N_exo = V_cellwall / V_exo =6w( D   w ) v/ d³_exo.。

而胞吞的速率可以根據胞吐的增加的膜面積減去胞吞的膜面積等于花粉管增加的膜面積來計算：dA_membrane = N_exo A_exo – N_endo A_endo，

   2) 囊泡的運動速度：全內反射熒光顯微鏡采集的圖像分析使用軟件Image-Pro Plus 5.1 (Media  Cybernetics), Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems), and Image J 1.34e  (Wayne Rasband, National Institutes of Health)。