實驗概要
通過本實驗，學習和掌握堿裂解法提取質粒的方法和技術。
實驗原理
質粒是基因工程中常用的載體之一。質粒是染色體外小型雙鏈環狀的DNA，大小在1～200kb之間。
堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們的。
在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環狀質粒DNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補鏈彼此纏繞，仍會緊密的結合在一起。當加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液，恢復pH至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構。
通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
主要試劑
1. 溶液Ⅰ
2. 溶液Ⅱ
3. 溶液Ⅲ
4. 70%乙醇
5. 胰RNA酶(10mg/mL)
6. 平衡酚
主要設備
1. 恒溫培養箱
2. 恒溫搖床
3. 臺式離心機
4. 高壓滅菌鍋
5. 移液槍
實驗材料
1. 葡萄糖
2. 三羥甲基氨基甲烷（Tris）
3. 乙二胺四乙酸（EDTA）
4. 氫氧化鈉
5. 十二烷基硫酸鈉（SDS）
6. 乙酸鉀
7. 冰乙酸
8. 氯仿
9. 無水乙醇
10. 胰RNA酶(10mg/mL)
11. 氨芐青霉素（100mg/mL Amp）
12. 平衡酚（pH8.0）
13. 鹽酸（HCl）
14. 含pGEX-4T-1質粒的大腸桿菌
15. 吸嘴（槍頭）
16. 小指管（離心管）
實驗步驟
1. 將25mL含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養基加入100mL錐形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1質粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養過夜。
2. 收菌，吸取1.5mL培養物加入1.5mL離心管中，4000r/min室溫離心2min。
3. 吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。
4. 將細菌沉淀懸浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10min。
5. 加入200μL溶液Ⅱ(新鮮配制)，蓋緊蓋子，混勻內容物，將離心管放冰上5min。
6. 加入150μL溶液Ⅲ(冰上預冷)，蓋緊蓋子，顛倒數次使混勻。冰上放置15min。
7. 12000r/min離心15min，將上清轉至另一離心管中。
8. 向上清中加入等體積酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反復混勻，12000r/min離心5min，將上清轉至另一離心管中。
9. 向上清中加入2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置5～10min。
10. 12000r/min離心5min，倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
11. 用1mL70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，振蕩，12000r/min離心5min，倒去上清液，空氣干燥。
12. 加20μL純水(含20μg/mL胰RNA酶)，使質粒DNA完全溶解，－20℃保存。
（注：1mL純水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解質粒的純水。）
13. 在下次實驗中觀察實驗結果，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA。