一.流式細胞光度術－單細胞懸液染色標本的多信息分析法
1.概述
流式細胞光度計(flow cytometry)可定量地測定某一細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細胞群體中上述成分含量不同的細胞的數量，特別是它還可將某一特異染色的細胞從數以萬計的細胞群體中分離出來，以及將DNA含量不同的中期染色體分離出來，因此近年來得到越來越廣泛的應用。
細胞群體一般需要分散后對待測的某種成分進行特異染色，然后將懸液中的細胞以1個細胞／ms的速度(1 000萬細胞/h)一個個地通過流式細胞儀，此時檢測器便可測出并記錄每個細胞中的待測成分的含量，并根據要求將該成分含量不同的細胞分離出來。如果染色過程不影響細胞活性，那么分離出來的細胞還可以繼續培養。
2.工作原理
流式細胞光度計(簡稱FCM)是將流體噴射技術、激光技術、空氣計數、γ—射線能譜術
及電子計算機等新技術與顯微熒光分光光度計密切結合的高度精密儀器。在電子計算機操作 程序控制下能靈敏而快速地對大量單細胞樣品進行多信息分析與測定。目前，FCM技術已廣泛地應用于生命大分子物質的定量、細胞周期分析、細胞表面抗原、受體、染色體、核漿比例、活細胞分類等細胞生物學各領域的研究工作中。
其主要工作原理是：經熒光染色的單細胞懸液被高壓壓入流動室內，在PBS或生理鹽水等殼液(Sheath Fluid)的包裹和推動下形成單細胞狀態，并以每分鐘5000—10000個細胞的高速度從流動室內噴出。在與細胞束呈90°角的方向，受到來自氬離子激光器的激光束照射而激發熒光。通過各種物鏡及濾光片將從不同角度收集的熒光投射到光電倍管并轉換為各種強弱不等的電脈沖信號顯示出來。這些信號輸到電子計算機中貯存，經處理和分析便可得到多種信息參數。進行細胞分類時，根據需要對含細胞的水滴選擇性充電，在帶有高電壓的偏轉板作用下，帶正電荷的水滴落入左方收集管內，帶負電荷的水滴落入右方收集管內，不帶電荷的水滴進入中間的收集管。分類主要根據細胞的熒光強度，即單細胞DNA含量。
3.FCM系統調試：
以FACS-Ⅲ型機為例，調試的原則是：得到較高的分辨率，即對某一特殊樣品測得的變 化常數CV值，CV值越小越好。得到較高的靈敏度，即可測出最小熒光分子數。
調試儀器要有理想的標準品，其條件是：①穩定；②顆粒大小和熒光性要均勻；⑧標準 品本身的CV值要低于儀器的CV值；④易得，易制成懸液。目前常用的標準品有：④熒光 微球，⑥雞紅血球懸液，它易得，制備方法簡單，易保存，且血紅蛋白可自發熒光。
4.樣品制備過程
著重介紹單細胞懸液的制備方法，這是生物學工作者最為關心的問題。懸液培養樣品或 各種腹水細胞本身就是單細胞懸液，可直接使用。下面介紹單層培養樣品及實體組織的制備方法。
Ⅰ 酶法：應用最廣泛的是胰蛋白酶。
(1)單層培養的樣品：器材和試劑：玻璃滴管數只(滅菌)；5ml移液管5只(滅菌)；10ml移液管3只(滅菌)；離心管數只(滅菌)；滅菌超凈臺；恒溫水浴箱；離心機、冰箱；PBS液(滅菌)；胰蛋白酶溶液。
步驟：①去掉培養基；②用5ml冷PBS滴輕輕沖洗細胞后去掉；⑧加2毫升胰蛋白酶液，37℃保溫5分鐘，輕輕搖動培養瓶或用滴管吹盯數次使細胞最大程度游離；④加8ml含血清的培養基以抑制酶活性，⑤把細胞懸液移到離心管內，250g離心5分鐘；⑥棄上清，將細胞重新懸于10ml冷PBS中，攪勻；⑦250g離心5分鐘，棄上清加5ml乙醇固定，保存于4℃備用。
(2)實體組織：器材和試劑：眼科剪、眼科鑷各一把；50ml小燒杯數個；玻璃滴管數只；小塊雙層紗布；普通光學顯微鏡；恒溫水浴箱；離心機；Hank’s平衡鹽水；分離液；中和液。
步驟：①將組織塊剪碎，以Hank’s平衡鹽水洗去紅細胞；②加分離液，37℃水浴，輕輕攪拌直到液體混濁；⑧在顯微鏡下檢查細胞分離情況；④靜置數分鐘后輕輕倒出懸液，以雙層紗布過濾，剩下的細胞團塊可重新加分離液分離；⑤加入與細胞懸液等體積的中和液；⑥用滴管吹打10次，室溫下靜置5分鐘后再放在冰上，⑦250g離心5分鐘；棄上清，細胞重新懸于生理鹽水中備用。
對于不同組織，酶用量和pH均可改變。除胰蛋白酶外，還可以用膠原酶、胰肽酶E、透明質酸酶或聯合使用。
Ⅱ 化學法：
因為酶可以消化細胞膜上的某些成份，所以有人用非酶物質分離細胞。用TPB(tetraphenylborom)分離肝、腦、腎和結締組織，但TPB能抑制細胞代謝。下面簡單介紹Rappapont和Howze用TPB鈉鹽分離C3H小鼠肝臟細胞的過程。
器材和試劑：薄刀片；10ml移液管2只；玻璃滴管數只；帶22號針頭的注射器1個；磷酸緩沖液；蔗糖-鹽溶液；TPB分離液。
步驟：①將肝組織切成3—5ml的薄片；②加10mlTPB分離液；③冰浴1—2小時，并用滴管上下吹打數次；④將細胞液通過一22號針頭，形成單細胞，⑤250g離心5分鐘，并以生理鹽水洗2次去掉分離液。
被分離的肝細胞數目隨TPB濃度的增加而增加，其最適濃度范圍是每升10的負5次方至10的負2次方摩爾。
Ⅲ 機械法：
通常是將實體組織切碎，用帶金屬網或尼龍網的注射器制成單細胞。但此法易引起細胞破碎和丟失。Crissman(1976)的方法是：①將實體瘤切碎；②碎組織通過一500nm孔徑的Teflon網；⑧細胞被收集于生理鹽水液中；④此細胞懸液被通過一個100或60nm孔徑的尼龍GM篩；⑤離心使細胞沉淀；⑥細胞沉淀直接懸液于染色液中。
上述三種方法各有優缺點，最好是聯合使用。