| DNA的變性 DNA的復性 核酸分子雜交 變性(denaturation)和復性(renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特性。也是核酸研究中經常引用的術語。雙鏈DNA,RNA雙鏈區,DNA: RNA雜種雙鏈(hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子(heteroduplex) 都具有此性質。(1)DNA的變性： 指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。確切地就是維持雙螺旋穩定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA變性不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。變性能導致DNA 以下一些理化及生物學性質的改變。 溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的"剛性"結構,變性后代之以“柔軟” 而松散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。 溶液旋光性發生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變, 使DNA溶液的旋光性發生變化。 增色效應或高色效應(hyperchromic effect)。指變性后DNA 溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子具有吸收250－280nm波長的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎,但雙螺旋結構有序堆積的堿基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開,堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收,故而產生增色效應。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀測此效應的指標,變性后該指標的觀測值通常較變性前有明顯增加, 但不同來源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經熱變性后,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來源的DNA溶液的增值范圍多在20－30%之間。 以加熱為變性條件時,增色效應與溫度有十分密切的關系,這主要是變性溫度取決于DNA自身的性質。熱變性使DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature,簡寫Tm)。因熱變性是在很狹的溫度范圍內突發的躍變過程, 很像結晶達到熔點時的熔化現象,故名熔解溫度。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型。S型曲線下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時,次級鍵突發斷開,DNA迅速解鏈,同時伴隨吸光率急劇上升,此后因"無鏈可解"而出現溫度效應喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測DNA的50%發生變性的意義,即增色效應達到一半的溫度作為Tm,它在S型曲線上,相當于吸光率增加的中點處所對應的橫坐標。不同來源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義，首先是指DNA分子中堿基組成的均一性,如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值范圍就較窄。因前者在變性時的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進行,故所要求的變性溫度更趨于一致。其次還包含有待測樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值范圍較窄, 若混雜有其它來源的DNA,則Tm值范圍較寬。其原因顯然也與DNA的堿基組成有關。 總的說,DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值范圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C堿基對越多,Tm值越高。此點是易于理解的,因G-C堿基對具有3對氫鍵,而A-T堿基對只有2對氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強結構的穩定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實驗說明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著密切相關性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分數的這種關系可用以下經驗公式表示(DNA溶于0.2mol/L NaCl中):X%(G+C)=2.44(Tm-69.3) | ||
(2)DNA的復性：
指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性,此過程稱之為" 退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡要說明之。
溫度和時間。變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特征可以基本恢復到第一次變性曲線的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動顯著減弱互補鏈結合的機會自然大大減少。從熱運動的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利于復性。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。
DNA濃度。復性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核”。這一過程進行的速度與DNA濃度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會越大。
DNA順序的復雜性。簡單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時,互補堿基的配對較易實現。而順序復雜的DNA,如小牛DNA的非重復部分,一般以單拷貝存在于基因組中,這種復雜特定序列要實現互補,顯然要比上述簡單序列困難得多。在核酸復性研究中,定義了一個Cot的術語,(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時間),用以表示復性速度與DNA 順序復雜性的關系。在探討DNA順序對復性速度的影響時,將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)取對數后對Cot作圖,可以得到如圖所示的曲線,用非重復堿基對數表示核酸分子的復雜性。如多聚(A)的復雜性為1,重復的(ATGC)n組成的多聚體的復雜性為4,分子長度是105核苷對的非重復DNA的復雜性為105。原核生物基因組均為非重復順序,故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接與基因組大小成正比,對于真核生物基因組中的非重復片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度,400核苷酸的長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cotl/2),與核苷酸對的復雜性成正比。對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列（repetitive sequence)，所得到的Cot曲線要上圖中的S曲線復雜。
(3)核酸分子雜交：
分子雜交(簡稱雜交,hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗技術。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質,使來源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質就是在一定條件下使互補核酸鏈實現復性(加熱或堿處理)使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術也是核酸雜交的一個環節。
若雜交的目的是識別靶DNA中的特異核苷酸序列,這需要牽涉到另一項核酸操作的基本技術─探針(probe)的制備。探針是指帶有某些標記物(如放射性同位素32P,熒光物質異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。若我們設法使一個核酸序列帶上32P,那么它與靶序列互補形成的雜交雙鏈,就會帶有放射性。以適當方法接受來自雜交鏈的放射信號,即可對靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別。在現代分子生物學實驗中,探針的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術手段。核酸分子雜交作為一項基本技術,已應用于核酸結構與功能研究的各個方面。在醫學上,目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷(gene diagnosis),惡性腫瘤的基因分析,傳染病病原體的檢測等領域中,其成果大大促進了現代醫學的進步和發展。