IS PCR的技術特點 （1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準確性；（2）測到低于2個拷貝量的細胞內特定DNA序列，甚至可檢測出單一細胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細胞內特定核酸序列定位與其形態學變化的結合分析；（4）可用于正常或惡性細胞，感染或非感染細胞的鑒定與區別。 IS PCR的基本方法 IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術的綾事，實質是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進行原位雜交的技術，操作程序基本兼有兩種技術的所有過程，首先在適當處理的細胞和組織切片上滴加PCR反應液，然后把載玻片放入熱循環儀中進行擴增，最后通過標記的探針進行原位雜交檢測擴增產物。 初步應用 有關原位PCR技術應用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經系統visna病毒在綿羊脈絡從一細胞中檢查，通過PCR擴增，僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細胞內的visna病毒。從開始在試管內細胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統的標記探針的原位PCR法（間接法），也有將標記物先標記PCR的引物，讓標記物擴增后再行ISH檢查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡便，各家報道的原位PCR技術中，在標本處理和種類上尚不同（細胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測的靶核酸也不同（病毒或體細胞的DNA或mRNA），擴增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經驗，以求一致。 原位PCR應用的課題，目前正片于開始階段，還很局限，對人體B細胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細胞HLA-DQ不同亞型的測定，歸納起來，主要應用于兩方面；（1）檢測外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。 基因轉染技術 將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發展，并使基因治療成為可能。目前基因轉移技術已廣泛用于基因的結構和功能分析、基因表達與調控、基因治療與轉基因動物等研究。本部分將介紹目前基因轉移的主要方法；重點介紹基因轉移的病毒方法的基因轉染（transfection）技術。 基因運載系統 將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞，需要應用某一基因運載系統，目前將這一系統概括為兩大類：非病毒辣方法和病毒方法。 1.基因轉移的非病毒方法 直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入DNA燕進行表達，在肌細胞中，基因表達可持續數月。 磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細胞膜并經過細胞內吞作用耐是入細胞質。該方法的轉化效率通常很低。 脂質體染法 指質體能在體內或體外提供運載外源性遺傳物質進入細胞的載體。脂質體介導的基因轉移的最大優勢在于能在活體內應用。 受體介導的基因轉移 依靠受體介導的細胞內吞途徑以轉移外源基因。受體介導的基因轉移方法是在質粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復合體，而這種多肽能為細胞表面的肥體所識別。如若將DNA在體內運送至肝內，可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結合的去唾液酸糖蛋白質偶聯，以便通過細胞內吞過程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應用該方法轉移的外源基因在活體內的表達持續時間較短，在評估實際應用前影上還在一些問題。 顯微注射法 在顯微鏡下，將DNA經同細胞玻璃針地接注入細胞，該法適合于各種培養生長的細胞，但需要一定的設備和操作用支巧。 電穿孔法 利用脈沖場將DNA導入培養細胞。 微粒子轟擊法（基因槍）近幾年發展較快的轉移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導入培胞或活的哺乳動物組織內。亞微粒的鎢和金能自發地吸附DNA，將這些微彈加強速到很的速度轟擊細胞。實驗結果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細胞中表達。 胚胎干細胞法 胚胎干細胞是從受精卵開始分裂至4個國胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細胞，能在體外培養，可作為正面細胞，制備轉基因動物，以研究基因定向整合或基因剔險及基因及能。 精子載體法 最近發現用精子和NDA-劑孵育，可捕獲得DNA。通過受精過程，將外源性基因導入受精卵，可捕獲得物物，大大間化了轉基因動物的制備過程。 2.基因轉移的病毒的方法 病毒作為基因轉移的是基因遞送有有并工具，病毒載體的優點有：（1）在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩定的遺傳成分；（2）在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調節信號的控制下以進行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進分離；（4）轉移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp。目前常用的病毒載體有下列幾種。 逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上，病毒進入細胞通過逆轉錄作用，病毒RNA即轉變為雙鏈DNA分子，DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復序列（LTR）,LTR內側還有為復制所必需的其他順序，包括包裝信號。目前常用的逆轉病毒載體有CMV和SV。 DNA病毒載體 主要有腺病毒相關病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對DNA病毒載體的研究是當前基因基因治療研究中的重點領域。 常用的基因轉染技術 將外源基因導入靶細胞需要一定的載體和導入方法，基因轉技術則是將純化的含有靶基因的質粒DNA送入細胞內，并在細胞內表達。轉染方法有多種，根據不同的細胞，貼壁或懸浮細所可選用不同的方法，其目的是要達到設置轉染效率，影響轉染產率的因素有多種，包括轉染方法、操作技術、質粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態等，下面重點介紹向幾種常用的轉染技術： 靶細胞的準備 被用于作靶基因轉染的細胞，其生長狀態如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。 靶基因質粒DNA的準備 用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其了化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。 具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后，一般在轉染后48小時，靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。 轉基因動物的建立和應用 轉基因動物是以實驗方法交源基因導入宿主受精卵或早期胚胎細胞染色體基因組內，使其穩定整合和遺傳給后代動物。它主要采用顯微注射法、逆轉錄病毒載體感染法、精子載體法、電轉移法與胚胎干細胞法。 轉基因動物模型的建立，推動了腫瘤在分子水平上的研究，它使人們認識到激活的原癌基因的異常表達及功能失常，是腫瘤發生的初階段。將癌基因與特定細胞的調控序列連在一起，可使癌基因在特定細胞中表達，研究靶細胞對不同癌基因的易感性，闡明某一癌基因對特定細胞生長、分化及功能的影響；它還可以研究多種基因的協同作用，有助于對多步驟致癌機進行深和的探討。 轉基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，還可以通過使某一基因功能丟失（如用基因剔除技術）研究抑癌基因在腫瘤發一中的作用。另外，轉基因小鼠對致癌原的測試，為腫瘤的預防，治療及發現新的致癌物質都提供了有價值研究工具。