目前檢測ESBLs的常用方法有雙紙片協同試驗（即阿莫西林雙紙片協同試驗與替卡西林雙紙片協同試驗，以NCCLS紙片表型確證試驗測定結果為標準，篩選出產ESBLs）、紙片表型確證試驗、瓊脂稀釋法確證實驗、三維試驗等。
1.篩選試驗:選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松(每片含量均為30μg)藥敏紙片中的至少2種,用苗勒-欣頓(MHA)瓊脂,標準紙片擴散法測試抑菌環直徑,按美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)1997年標準進行判斷。凡頭孢泊肟或頭孢他啶的抑菌環直徑≤22mm,頭孢曲松≤25mm,氨曲南或頭孢噻肟≤27mm,均應高度懷疑為ESBLs菌株,應進一步作確認試驗來加以確診。
2.確認試驗:用頭孢他啶(每片30μg)和頭孢他啶加克拉維酸(30μg和10μg);頭孢噻肟(每片30μg)和頭孢噻肟加克拉維酸(30μg和10μg);分別測量2種紙片單獨及加克拉維酸的抑菌環直徑。加克拉維酸較不加克拉維酸的抑菌環直徑≥5mm可確認為ESBLs菌株。
質控菌株:大腸埃希菌ATCC25922(頭孢他啶:頭孢他曉+克拉維酸≤2mm;
肺炎克雷伯菌ATCC700603(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸≥5mm)。
1.篩選試驗:選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上,用陽離子增強的MH肉湯(標準肉湯稀釋法)稀釋至1mg/L,凡被測菌在上述各管中能夠生長(MIC≥2μg/ml),均應高度懷疑為ESBLs,應進一步作確認試驗來加以確診。
2.確認試驗:用標準肉湯稀釋法測定MIC的方法,按NCCLS(1997)推薦的篩選和確認ESBLs的標準進行判斷。選用頭孢噻肟單獨稀釋(范圍0.25~64mg/L)及頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維酸(每管4mg/L);頭孢他啶單獨稀釋(范圍0.25~128mg/L)及頭孢他啶加克拉維酸(每管4mg/L),上述2種藥物必須同時進行試驗,結果加克拉維酸和不加克拉維酸的MIC差值如≥8倍(3個稀釋度),可確認為ESBLs菌株。質控菌株:大腸埃希菌ATTC25922(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸<8倍);肺炎克雷伯菌ATCC700603(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸≥8倍)。
1.在MicroScan的一些藥敏試劑條中包括了頭孢泊肟、頭孢他啶或氨曲南,且每種試劑條均有2種指示藥物,當被試菌對這些指示藥物的MIC≥2mg/L時,即可篩選出可疑的ESBLs菌株,符合NCCLS(1999)推薦的篩選藥物組合及濃度范圍,可用于ESBLs的篩選。
2.用濃度梯度法(Etest法)的常規試條中的三代頭孢菌素或氨曲南(2種以上),凡MIC≥2mg/L時,即高度懷疑為ESBLs,應進一步作確認試驗來加以確診。現有2種Etest法的ESBLs確認試條,分別是頭孢噻肟及頭孢噻肟加克拉維酸、頭孢他啶及頭孢他啶加克拉維酸。檢測結果加克拉維酸和不加克拉維酸的MIC差值≥8倍（3個稀釋度）,可確認為ESBLs菌株。
Etest檢測ESBLs的具體操作步驟是
(1)在常規試驗中選出對三代頭孢MIC≥1mg/L的菌株(比NCCLS的標準低一個稀釋度);
(2)按NCCLS(1999)推薦的方法,用2種底物篩選和確認ESBLs(篩選試驗:在頭孢噻肟或頭孢曲松中選1種,頭孢他啶或氨曲南中選1種。
確認試驗:用頭孢噻肟和頭孢他啶);
(3)確認該菌對頭孢西丁的MIC≤8mg/L,以排除質粒AmpC酶;
(4)再測定該菌對其他非β內酰胺抗生素的藥敏模式,以指導抗菌治療或收集流行病學資料。
1.雙紙片擴散法:藥敏平板和菌液的制備方法與常規藥物敏感試驗相同,將菌液涂布在，MH瓊脂平板上,貼上藥敏紙片,1張為三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟或頭孢曲松)或氨曲南,1張為含有β內酰胺酶抑制劑(克拉維酸10mg/L)的紙片,兩紙片相距20~30mm(中心-中心),35℃孵育18~24小時,觀察結果。如顯示協同為陽性。
2.三相擴散法:該法又有直接法和間接法2種。直接三相擴散法是在紙片擴散法的基礎上略加改動,首先按標準紙片擴散法進行操作,貼上藥敏紙片,在離紙片3mm處打一個小孔(靠近平板中央一側),內加200μl濃度為105~106的菌液,35℃孵育過夜,如在頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松或氨曲南周圍的抑菌圈形狀發生改變,試驗為陽性。如果在上述抗生素周圍的抑菌圈很小或沒有抑菌環,應該用間接法重復。間接三相擴散法與直接法不同在于,直接法平板表面涂布的細菌和小孔內的細菌是相同菌,而間接法平板表面涂布的細菌是用已知對。
上述藥物均敏感的菌株如大腸埃希菌ATCC25922,小孔內為試驗菌。如出現試驗菌孔干擾敏感菌株形成抑菌環的現象即判斷為陽性。該試驗的優點在于可以同時了解細菌對抗生素的敏感情況和產ESBLs的情況,但需要有經驗的人員來判斷結果。
此外,尚可用生物化學技術檢測ESBLs的等電點(等電聚焦電泳),或分析酶的底物譜及抑制物譜來分型。也可用分子生物學技術檢測和分析編碼ESBLs的基因或突變位點,如聚合酶鏈反應(PCR)-SSCP、PCR-限制性內切酶試驗、PCR-點雜交、DNA探針或序列分析等。