O. Henegariu, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance and P.H. Vogt
Indiana University, Indianapoils, IN, USA and Heidelberg University, Heidelberg, Germany
摘要：
多重 PCR 通過在同一個反應中同時完成多個基因的擴增成為臨床與基礎研究領域中一種簡便快捷的篩選檢測方法。已有大量文獻詳細的討論了通常影響 PCR 反應質量的條件，而在多重 PCR 中常見的困難和重要的實驗因素卻鮮見報道。本文使用多對引物對多重 PCR 的各種條件進行了研究。研究表明，對于成功進行多重 PCR 尤為重要的因素是：用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、 PCR 緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和 dNTP 濃度間的平衡。在實驗的基礎上，本文給出了一個多重 PCR 的標準方法，并給出常見問題的解決辦法。
介紹：
多重 PCR 就是在同一個反應管中同時完成多個不同基因擴增的 PCR 反應。這一方法最早報道于 1988 年 （ 6 ） ，已被成功的用于缺失分析 （ 2,8 ） ，突變 （ 14 ） 與多態性 （ 11 ） ，以及定量分析 （ 10 ） 與反轉錄 PCR （ 7 ） 等多個 DNA 檢測領域。
PCR 反應中各種試劑的作用已被討論過 （ 3,9,12,13 ） ，也已有許多研究團體對多重 PCR 的方法進行了描述。但是很少有人對影響多重 PCR 結果的因素（如引物濃度、循環條件等）進行過深入的討論 （ 5,15 ） 。本實驗使用常規含 KCl 的 PCR 緩沖液對 50 種基因的各種組合進行了多重 PCR 反應，針對伴隨多重 PCR 的一些問題，如均一性差、某些基因難以擴出、重復性差等問題，對影響擴增的相關參數進行了研究。基于實驗經驗我們設計了多重 PCR 的標準方法 (Figure 1) ，并提供了對可能碰到的許多問題的解決方案，這對于臨床與基礎研究領域中使用 PCR 技術的工作者都會有所幫助。
材料與方法：
PCR使用的標準溶液和試劑
100 mM 母液的核苷酸 (dNTP) ( 購于 Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] 或 Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) (25 mM each dATP, dCTP, dGTP and dTTP).
標準的 10xPCR 緩沖液 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 包含： 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3[at 24 ℃ ], 15 mM MgCl 2 .
Taq DNA 聚合酶 (Life Technologies [Gaithersburg, MD, USA]; Perkin-Elmer).
二甲亞砜 (DMSO), 牛血清蛋白 (BSA), 甘油 (Sigma Chemical [St. Louis, MO, USA])
引物 (Genosys [The Woodlands, TX, USA]; Research Genetics [Huntsville, AL, USA])( 終濃度為 10–25 pmol/μL 。引物對 sY 用作檢測 Y 染色體上的缺失 (8,16) ；還有 10–15 對引物用于檢測 X 染色體上迪謝內肌營養不良基因 (DMD) (4) ；其余引物用于檢測 12 號染色體上的多態性位點，引物按 Table 1 和 Figures 2b, 3b,5e 方案組合。
基因組 DNA 使用標準 SDS/ 蛋白酶 K 方法制備 (Boehringer Mannheim)
基本 PCR程序
PCR 反應體積為 25μL ，包括：滅菌的超純水、 PCR 緩沖液 (1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因組 DNA 模板 (150ng/25μL) 。先加入水，其它組分可以任意順序加入，加樣在冰上進行，加樣完成后反應管直接從冰上轉入預熱到 94 ℃的循環儀加熱模塊或水浴中。對于放射性標記的反應，在反應開始前立即在 100μL 的反應混合液中加入 1 μCi [ 32 P] dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL,USA) 。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反應體積得到的結果相同，對于小的反應體積，加樣（尤其是 dNTP ）至關重要。實驗中使用了各種 PCR 儀，經過細微調節后都得到了好的實驗結果。
PCR產物的凝膠分析
在 3%SeaKem ? LE 或 NuSieve ? (3:1) 瓊脂糖凝膠 (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) 上對 X 、 Y 染色體上非多態性位點的 PCR 產物進行分離，電泳緩沖液分別為 1xTAE [0.04M Tris-acetate; 0.001 M EDTA (pH8.0)] 或 1xTBE [0.09 M Tris-borate; 0.002 M EDTA (pH 8.0)] 緩沖液，電泳在室溫下進行，電場強度為 7–10V/cm 。 PCR 產物的上樣體積相同，電泳后凝膠用 0.5–1 μ g/mL EB 染色。
當檢測位點為多態性位點或需要更高的分辨率時使用測序膠 (6% 聚丙烯酰胺 [PAA]/7 M 尿素 ) 。與上樣緩沖液混勻后，每泳道加入約 0.2 μ L 放射性標記的 PCR 產物。凝膠在 0.6xTBE 緩沖液中在 1800–2000 V (60A) 條件下電泳兩小時。過夜曝光后得到自顯影圖像。
結果與討論 :
在大量實驗的基礎上，如 Figure1 所示設計出了多重 PCR 的標準方法，其中也包括了許多經常遇到的問題的解決方案。為了便于使用，用斜體字將步驟表與材料和方法中的各點及以下部分聯系起來。
