梅毒分子生物學實驗診斷方法的研究進展

裴瑞青綜述；曾鐵兵，吳移謀審校
(南華大學病原生物學研究所，衡陽421001)
摘要：梅毒的臨床表現十分復雜，診斷主要依靠實驗室檢測方法。傳統的梅毒實驗室診斷方法暴露出諸多缺點，本文綜述了國外一些分子生物學技術用于梅毒實驗室診斷的方法(以基因工程重組抗原的血清學方法和聚合酶鏈反應)的研究進展。
關鍵詞：梅毒；重組抗原；PCR；分子生物學技術
中圖分類號：R377 ．1 文獻標識碼：A 文章編號：1005—5673(2010)02-0075—04
梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)感染引起的慢性疾病，在性傳播疾病(Sexxuallytransmitted disease，STD)中其危害性和致死率僅次于艾滋病，它還可垂直傳播，嚴重影響嬰幼兒健康。梅毒的臨床表現極其復雜，診斷依據主要為實驗室檢測法，但傳統的實驗室診斷方法在特異性、敏感性、成本、自動化等方面均存在較多缺點。近些年來，隨著現代分子生物學技術的發展，通過基因工程技術一系列重組Tp蛋白(rTp)被成功表達，基因診斷方法也不斷更新。本文就國外以rTp為診斷抗原的Tp抗體檢測方法及Tp基因診斷方法一聚合酶鏈反應(PCR)對梅毒的實驗診斷進展作一綜述。
1 基于rTp抗原的梅毒血清學方法的研究進展傳統的梅毒血清學方法是檢測非TP特異性抗體(反應素)和TP特異性抗體。前者主要有性病研究實驗室玻片試驗(VDRL)、快速血漿反應素環狀卡片試驗(RPR)和甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗(TRUST)，其共同的主要缺點是生物學假陽性高，因此限于梅毒的篩查；后者主要有熒光密螺旋體吸收試驗(FI'A—ABS)、Tp血凝試驗(TPHA)、rrp明膠凝集試驗(TPPA)及Tp微量血凝試驗(MHATP)，所用診斷抗原為TP天然抗原，可用于梅毒的確診。但TP尚不能人工培養，來源困難，加工和純化復雜，易被兔睪丸組織污染，且與其它螺旋體存在共同抗原，因而試劑成本高，也存在一定的假陽性。通過基因工程可大規模獲得重組抗原，大大降低了成本，降低交叉反應而提高了特異性。近年來TP的一系列重組抗原被成功地表達，目前所用的診斷抗原主要為重組蛋白Tp47、Tp15、Tp17、Tp44．5(TmpA)、Tp37等的2種以上的混合抗原(敏感性高于單一抗原)，這些重組抗原可被廣泛地用于多種梅毒的診斷檢測方法。
1．1 重組TP抗原酶聯免疫吸附試驗(rTP—ELISA)rTP．ELISA以重組抗原作為已知抗原，檢測總特異性Tp抗體(主要為IgG和IgM)或特異性Tp抗體的類別(如IgG或IgM)。國外已有多種商業化的rTP．ELISA梅毒診斷試劑盒，主要包括ICE Syphilis(Murex，英國)、recomWell Treponema((Mikrogen，德國)(均以重組TpN15、TpN17、TpN47為診斷抗原)，INNO—uA Syphilis(Innogenetics，比利時)(以重組TpN15、TpN17、TpN47和合成肽TmpA為診斷抗原)、Enzywell TP(Diesse，意大利)、Bioelisa syphi—lis(Biokit，西班牙)以重組TpN15、TpN17為診斷抗原。現對這些試劑盒的簡述如下：
Bruno[1 用5種以Tp裂解抗原和4種重組蛋白作為診斷抗原的商品化ELISA試劑盒(ICE Syph—ilis、Bioelisa Syphilis Trep—Chek、TmpA—ELISA Eurodiagnosfica，重組TmpA為診斷抗原)檢測52份MHA—TP陰性的早期梅毒血清，19S IgM FTA—ABS(全TP為診斷抗原)和上述4種rTP—ELISA的靈敏度分別為90．4％ 、75．O％ 、67．3％ 、63．4％ 和48．5％ ，高于VDRL方法(44．2％)。同時以MHA—TP為參照，用ICE Syphilis和Enzygnost Syphilis(以Tp裂解物為診斷抗原)共對2 053份未知血清樣本檢測的特異性分別為99．5％ 和99．8％ 。-2 檢測124份梅毒陽性樣本，與TPHA比較，1]PPA、ICE Syphilis和Enzywell TP的符合率分別為96．7％ ，100％ 和99．1％ 。Viriyataveekul 用Enzygnost Syphilis、Syph—ilis EIA 480和ICE Syphilis檢測3055份血清，與TPHA和／或FTA—ABS比較，特異性和靈敏度分別為100％ 和97．89％ 、100％ 和99．59％及99．1％ 和99．76％。Ebel【4 檢測840份血清，與傳統血清學方法比較，INNO—UA Syphilis試劑盒獲得了99．6％特異性和99．5％靈敏度，認為可作為梅毒確診試劑盒。Hagedom 檢測的289份陽性血清、219份陰性血清和23份不確定血清，與TPHA和IgG—FTA．ABS的檢測結果進行對照，INNO-uA Syphilis的靈敏度和特異性分別為100％和99．3％ ，認為該試劑盒比這兩種傳統方法可信度更高，是一種確診梅毒的試劑盒。Sambri L6 檢測了782份不同人群的血清，與以TP全細胞裂解物為診斷抗原的ELISA(Syphilis Screening)和MHA —TP試劑盒比較，recomWell Treponema試劑盒總的特異性為98．9％，靈敏度為98．3％ ，認為recomWell Treponema試劑盒在各期梅毒篩查中高度特異、敏感，是天然Tp診斷抗原ELISA檢測的替代方法，尤其適用于TP—IgM檢測。Young ¨將Enzywell TP和Syphilis ICE(初篩標準)比較，兩者特異性相似，靈敏度相似且高于I；TA·Abs，與Ⅱ’PA相當，認為Enzywell TP是一種簡便、高度特異和敏感的梅毒診斷方法。Ebel 用Bioelisa syphilis試劑盒檢測434份TPHA和FrAabs陽性的血清，顯示出99．5％的靈敏度和99．4％的特異性，認為這是一種靈敏、特異、快速的試劑盒。Dommelen-9 檢測145例TPPA陽性、41例健康陰性對照和144例嗍陰性血清，Bioelisa syphilis與ETI—Treponema Plus(Diasorin S。P．A．，西班牙)試劑盒都有100％特異性和100％靈敏度，遠高于一步法免疫層析法(Biorapid Syphilis)。
大量的臨床評價表明，rTP-ELISA方法具有特異性和靈敏度高、成本低，操作簡便、結果客觀準確、實驗室設備要求低等優點，適合大批量血源篩選和臨床梅毒病人的確診，若檢測特異性IgM，還可作為梅毒復發感染、療效判斷及區分母體梅毒和先天性梅毒胎兒的重要依據 J，被公認為是梅毒血清學診斷的首選方法¨引。目前所用抗原是上述5種重組抗原中2種以上的混合抗原，近年來也有將多個基因構建在同一個載體來表達的重組融合蛋白作為診斷抗原，如rTPN15—17-47 。1．2 重組抗原蛋白印跡法(Immunoblotting或West—em blot．WB)
WB結合了免疫學和分子生物學的特點，敏感度與特異性均很高，是國際上公認的確認試驗中的“金標準”。Sambri¨ 對五種重組抗原(TpN47、Tm—pA、TpN37、TpN17和TpN15)進行WB(recWB)，檢測450份血清標本中TP—IgG，與全細胞裂解抗原免疫印跡法(wclWB)和MHA—TP進行了對比。結果顯示，rTmpA最高檢出(95％)，其余從高到低依次分別為rTpN4(92．5％)、rTpN17(89．5％ )、rTpN15(67．5％)和rTpN37(41％)；recWB與MHA—TP的一致率為95．0％ ，與wclWB 的一致率為97．5％；以MHA—TP為參照，recWB的靈敏度與特異性均高于wclWB法。認為recWB可作為wclWB檢測的替代方法。目前已有多種recWB的商品化試劑盒，如IMMO-Lia Syphilis Score(Immuno genetics，比利時)、RecomBlot Treponema IgG／IgM (Mikrogen，德國)。與常規WB不同，這些試劑盒已預先將重組抗原分離在試劑條不同位置上，與待測特異性IgG或IgM結合后通過酶反應顯示條帶，由于不需電泳，因而操作十分簡便。Frigo¨ 用IMMO—Lia Syphilis Score檢測224份血清，顯示出100％靈敏度和98％特異性及100％重復性，是傳統檢測方法的補充。Kotnik_1 等用該試劑盒檢測26份三期可疑神經性梅毒患者血清和腦脊液中特異性Tp—IgG，與傳統檢測方法比較，能檢測靜止期和活躍期神經性梅毒腦脊液內IgG，是新一代檢測腦脊液中特異性Tp抗體的方法。商品化的recWB高度特異、靈敏、重復性好，簡便快捷，結果判斷客觀，是目前常用的梅毒確診方法。
1．3 重組抗原免疫層析法(Immunochromatographyassay，1CA)基于Tp重組抗原的免疫層析法是近幾年發展的一種十分簡便、快速的梅毒初篩血清學方法，適用于性病門診的快速檢測、街頭無償獻血者的篩查以及緊急用血。Sato¨副評價了商品化免疫層析試紙條(ItS)(Determine Syphilis TP，Abbott Lab．)，認為這是一種快速簡便、敏感特異的梅毒篩查方法，適用于邊遠地區健康機構。Montoya 檢測4789名孕婦標本，比較了ICS和RPR的精確度，以金標準作為參照，結果顯示在實驗室ICS的靈敏度為95．3％ ，而在健康機構檢測則為841％ ，RPR為70．7％。其特異性和陽性率二者則相當。Nessa【17]用ICS檢測684份女性性工作者，與金標準方法相比較，靈敏度為94．45％ ，特異性為92．6％ ，且于隨行醫務人員和實驗室專業人員中的檢測結果無顯著性差異，認為這是一種非侵襲性的梅毒快速篩查方法。免疫層析法雖然快速簡便，但Dommelen 用一步法免疫層析試劑盒Biorapid Syphilis和兩種ELISA 試劑盒(Bioelisa Syphilis 3．0和ETI—Treponema Plus)作比較，靈敏度92％ 和特異性79％ 均明顯低于ELISA檢測的均為100％ ，認為Biorapid Syphilis適于健康結構篩查而不適于醫院實驗室梅毒檢測。
1．4 重組抗原化學發光法(Chemiluminescence as．say，CHA)
CLIA是一種新型的定量、高度自動化的梅毒檢測方法。Marangoni-】 對重組Tp17的CLIA(LIAI—SON Treponema Screen，DiaSorin，意大利)進行了評價，其靈敏度99．2％僅次于recWB100％ ，明顯高于EIA 95．4％ 和TPHA 94．7％ ，特異性都達到了99．9％，認為CLIA是一種高度特異、敏感和自動化的梅毒篩查方法。Knight【19 3評價了LIAISON Tpallidum-specific assay(Diasorin，MN)，與CAPTIASyphilis—G EIA比較，結果表明該方法在梅毒初篩和確診檢測中都是一種非常敏感、特異的方法，適合于各種人群。Donkers 以重組Tp17的CLIA(IMMU—LITE 2000Syphilis Screen，美國)檢測681份孕婦標本作的評價，其靈敏度比bioelisa SYPHILIS 3．0(ELISA法)更高，認為CLIA比ELISA更為特異和敏感。CLIA檢測成本高，需要特殊昂貴設備，目前尚難以普及。
2 梅毒的PCR診斷方法
血清學方法是梅毒實驗室主要診斷方法，但對極早期感染梅毒及特殊類型的梅毒靈敏度較低，而直接檢測Tp的暗視野顯微鏡、免疫熒光染色等方法敏感性和特異性都較低。PCR方法是梅毒診斷常用的高度特異、敏感的分子生物學方法，在檢測早期梅毒、免疫功能低下的梅毒(如伴艾滋病梅毒)、先天性梅毒、神經性梅毒及判斷再感染和復發、區分其它螺旋體感染等方面有十分重要價值l2¨。目前PCR檢測Tp主要的靶基因有TP47、polA、16SrRNA、tpf一1、BMP、tmpA和tmpB等 J，以TP47和polA的特異性最高。選擇PCR診斷梅毒需要考慮患者所處的梅毒病程階段和樣本來源，以一期和二期梅毒的潰瘍和皮損拭子最為適宜，其它樣本如全血、腦脊液、羊水、活檢樣本、石蠟包埋組織也可作為待檢樣本，但靈敏度較低，需待進一步評價 ]。PCR類型有常規PCR、RT—PCR、巢式PCR、多重PCR(可同時檢測多種潰瘍樣本的病原體)、實時熒光定量PCR(rea1．time PCR)、多重實時熒光定量PCRL2 等。其中real—time PCR目前在實驗室診斷梅毒中較為常用，具有特異、靈敏、自動化、重復性好和可定量等優點，其主要的靶基因是TP47 L25]和po一1A[26]。 PCR檢測Tp主要缺點是假陽性較高、靈敏度受來源樣本和所處病期的限制、試劑盒成本較高、實驗室條件高、需特殊儀器，目前尚只能作為血清學方法的補充方法。
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血清學方法仍然是梅毒實驗室診斷的主要方法，以重組抗原作為診斷抗原的特異、靈敏、快速、簡便、低成本的血清學方法是發展趨勢，目前ELISA方法較為常用，適用于醫院內大批量血液的篩查，也可用于確診，而ICA適用于性病外展服務以及基層診療服務機構的快速篩查。WB和CLIA靈敏度和特異性都很高，可用于梅毒確診。但目前重組抗原仍不能檢測各期梅毒，需要進一步評價其它新的重組抗原在梅毒診斷中的意義 。PCR方法作為血清學方法的有效補充，適用于早期梅毒、胎傳梅毒、神經性梅毒及體液免疫功能低下等特殊類型的梅毒，但引物的特異性和靈敏度仍待提高。
參考文獻：(略)