我們試驗室作NORTHERN的一些總結，歡迎指正，謝謝。
Northern雜交
準備物品：50ml量筒1個 100ml量筒1個 300ml燒杯1個 250ml 燒杯1個 250ml的錐形瓶1個 10ml 離心管2個 大小盤各1個 鑷子1把 剪刀1把 DEPC水500ml 2，瓶玻璃棒1根 電泳槽、轉膜槽、梳子、雜交桶 以上物品均用DCPE水處理
一、試劑
1. 4 M LiCl (50ml) LiCl 8.478g定量至50ml，DEPC處理，滅菌。
2. 1 M Na3PO4 (50ml) 19.01g定量至50ml，DEPC處理，滅菌。
（注：該溶液配完后，可以溶解并消毒，但是不要放在4℃，其溶解性不好，放在室溫下仍有小結晶。）
3. 10% SDS (100ml) SDS 10g加入100ml DEPC水。
（注：含有SDS消毒容易噴出瓶塞，應用牛皮紙包扎緊）
4. 10% N-lauroylsarcosine (10ml) 0.2—0.45 um膜過濾。
5. BufferⅠ：Maleic acid buffer (500ml) 1× 用NaOH調pH為7.5，DEPC處理。
（注：調節PH時，需要的堿較多，可以直接加入固體粉末約2克。）
0.1M maleic acid 5.8g
0.15M NaCl 4.4g
6. BufferⅡ：Blocking solution 1% (100ml)
Blocking Reagent 1g，加入100ml maleic acid buffer，60℃溶解1小時，加入100ul DEPC處理，滅菌。
7. 洗液Ⅰ （500ml） 2×SSC，0.1%SDS DEPC處理 使用量：50ml/100cm2
20×SSC 50ml + 10% SDS 5ml + 水445ml
（注：含有SDS消毒容易噴出瓶塞，應用牛皮紙包扎緊）
8. 洗液Ⅱ （500ml） 0.1×SSC，0.1%SDS DEPC處理
20×SSC 2.5ml + 10% SDS 5ml + 水497.5ml
（注：含有SDS消毒容易噴出瓶塞，應用牛皮紙包扎緊）
9. Washing Buffer (300ml): Maleic acid buffer + 0.3% Tween 20 (v/v)
10. Detection buffer (200ml) DEPC處理）PH9.5
0.1M Tris-HCl 2.42g
0.1M NaCl 5M NaCl 4ml
50mM MgCl2 2.03g
11. High SDS hybridization buffer (50ml)，混勻，水浴或65℃烤箱1小時，置-20℃保存。
（注：使用時新鮮配置）
DEPC處理水 9ml
SDS 7% 3.5g
Formamide, deionized, 50% 25ml
20×SSC 12.5ml
1M sodium phosphate, pH 7.0 2.5ml
N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v) 0.5ml
blocking reagent, 2% 1g
12.1000ml
0． 01N的NaOH 0.4g
3M的NaCl 175.32g
13. 20×SSC (500ml) DEPC處理
3M NaCl 87.66g
0.3M sodium citrate 44.12g
用10M NaOH調pH7.0
14. 10×MOPS電泳緩沖液：小燒杯中MOPS 4.19g，加入DEPC水，3M乙酸鈉2.67ml，用10M NaOH調pH7.0，加入0.5M EDTA 2ml，用DEPC水定量至100ml，過濾除菌，倒入棕色瓶中，4℃保存。
15. 1M Tris-HCL （200 ml）
稱取Tris堿24.22g，加純水溶解，用濃鹽酸調pH8.0，定量至200ml，加入DEPC 200ul，過夜，消毒。
16. 0.5M Tris-HCl (pH7.4) / 1.5M NaCl
稱取Tris堿15.2g，加水約200ml。用濃鹽酸調pH7.4，再加入NaCl 43.83g，定量至250ml，高壓消毒。
17. loading buffer : 1ml, pH8.0
甘油（50%） 0.5ml
EDTA(1mM) 0.5M EDTA 2ul
0.25%溴酚藍 0.0025g
0.25%二甲苯青FF 0.0025g
DEPC水 0.48ml
18. 3mol/l乙酸鈉 100ml： 乙酸鈉40.8g，加入水溶解，10M NaOH調pH8.0，DEPC處理。
19. 0.5M EDTA 50ml：EDTA 9.31g，加入水溶解，10M NaOH調pH8.0，DEPC處理。
二、地高辛試劑盒標記cDNA探針（Cat No. 1093657）
1．DNA模板（0.5-3ug）15ul，沸水加熱10分鐘變性，迅速置冰浴中；
2．在冰上加入：
管5 hexanueleotide mix 2ul —六聚體引物混合物
管6 dNTP mixture 2ul—dNTP 混合物
管7 Klenow enzyme 1ul 聚合酶
3．混勻，短暫離心，37℃水浴20小時（至少60min）；
4．加入0.5M EDTA 2ul (pH8.0)，終止反應；
5．沉淀：加入4 M LiCl 2.5ul和預冷100%乙醇75ul，混勻，-70℃ 30分鐘或-20℃ 2小時。目的沉淀DNA探針
6．離心12000r, 15min，倒掉，再加入預冷70％乙醇50ul，離心數分鐘，倒掉；
7．空氣干燥，加入TE-buffer 50ul
（注：在揮發乙醇時，不能太干，防止DNA不溶解）
三、實驗操作
1、甲醛-瓊脂糖電泳
1） 36ml水溶解0.75g瓊脂糖，水浴至60℃，加入5ml 10×MOPS電泳緩沖液及12.3M甲醛(37%) 9ml（注：溶解在用微波爐溶解瓊脂糖，盡量防止水分揮發，可以使用底火1.5分鐘）
2） 鋪制凝膠，撥去梳子，放入電泳池，加入1×MOPS，約400ml，電泳緩沖液使其淹沒凝膠1mm左右；
（注：凝膠凝固較慢，應該放在4℃，約需要1小時，拔起梳子時，應該垂直、快速拔起，防止粘連，使底部暴露。）
3）在一EP管中加入以下物品，混勻，短暫離心，55℃保溫15分鐘；然后放在冰上加樣，以消除RNA的二級結構。
RNA樣品 11ul
10×MOPS電泳緩沖液 5ul
12.3M甲醛 9ul
甲酰胺 25ul
4）加入5ul加樣緩沖液，總體積55ul，混勻，在5v/cm電壓下（80mv）電泳至溴酚藍泳動了凝膠長度的2/3；約需要1.5-2小時。點樣時應該避免點在邊上的孔中，不利于轉膜時覆蓋橡膠膜。（注：剪膜大小約10x9cm，此時應該把用DEPC水把尼龍膜自然浸濕，約需要3h）
5）取出凝膠，用0.01N的 NaOH和3M NaCl洗滌15min×2次；
6）用真空轉移器把RNA從膠上轉移至膜上，以0.01N的 NaOH和3M NaCl為轉移緩沖液。 10cmHg，3 hr；
（注：連好真空泵后應該實驗一下，然后在放置凝膠，凝膠比較軟，應該果斷的把凝膠取出，并且反轉一下，利于轉膜，不能有氣泡，應該用玻璃棒輕輕趕出，液面始終高于凝膠才有效，避免加樣孔接觸尼龍膜邊緣，不利于抽真空，把凝膠取出后應該用含有溴乙啶的溶液浸泡，觀察轉膜效果）-
7）烘烤膜：120℃ 30分鐘 （或將膜RNA面朝下UV照射3-5分鐘）。（注：可以在此步進行斑點雜交，以檢驗后邊的步驟，在烤膜時應該用兩張干凈的濾紙包住，以防止膜在高溫下轉曲，發生交叉污染）
2、預雜交：加入雜交液，50℃ （或42℃）水浴3hr或過夜。（注：可以用68℃進行預雜交，而且應該預熱雜交液，在預雜交和雜交時轉速不能太快，大約8轉/min，而且轉膜面向內使之洗到膜）
3、雜交（2.5ml/100cm2）：在3ml雜交液中加入探針（10-100ng/ml），開始雜交16小時。（取標記探針約25ul，沸水加熱10min，迅速冰浴，加入雜交液中混勻，并避免起泡，50℃ 或42℃水浴或過夜，探針量應該提高在0.5-3ug，注意雜交液一定要回收，可以反復利用）
4、洗膜、檢測：
洗液Ⅰ （50ml/100cm2） 5min×2次
洗液Ⅱ （50ml/100cm2） 15min×2次，振蕩洗滌 （68℃）
washing buffer 2min，換袋
blocking buffer（100ml/100cm2） 30min
150 mu/ml of anti-DIG-AP in blocking solution（稀釋1:5000） 50ml, 30min
washing buffer (100ml/100cm2) 15min×2次（除去未結合的Ab）
detection buffer 20ml, 2-5 min（平衡膜）
color solution (detection buffer 10ml + 管9 200ul，新鮮配制) 30min (5min-過夜)。顯色期間不能晃動。顯色完后，把膜浸入水中10分鐘，干燥后保存。（注：應該放在黑暗密閉的容器中，避光、防止震蕩）
＊含標記DNA的雜交液可于-20℃保存并重復使用。使用前將雜交液100℃沸水浴10分鐘。
＊二次雜交：將已雜交過的膜浸于二甲基甲酰胺中，50-55℃水浴脫色數分鐘，用DEPC水漂洗后；除去探針：formamide,50%(v/v)，50mM Tris-HCl(pH8.0),SDS 1%(w/v)，將膜完全浸于液體中，68℃孵育1小時。在水中浸洗膜，然后置2×SSC。干燥膜或直接用于雜交。
＊Quantification procedure: 用dilution buffer(管3)稀釋試劑盒中DIG-標記的管1對照DNA（1:5,1:50,1:500,1:5000）與靶DNA探針（1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000），將其變性（沸水浴后迅速冰浴），各取1ul點到尼龍膜上，將膜于80℃ 2h或UV照射3分鐘，按標準步驟進行染色、顯色、照相。