二、DNA分子量標準的制備
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個片段,長度 分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
三、 瓊脂糖凝膠的制備
1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
3、膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據熒光條帶的深淺選擇)。
8、 DNA分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
9、 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪制標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
10、 DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。
[注意] 1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1小時完全降解1mg lDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。
3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
4、觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
5、 EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。
6、當EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。