核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交 
本技術可用于基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離后水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。 
(一)樣品DNA內切酶水解 
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。 
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液 
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4 
1mg/mL BSA 
100mmoL/L MgCL₂ 
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇) 
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O 
0.5mol/L Nacl 
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O 
1.0mol/L Nacl 
2、操作步驟： 
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入適量H₂O總體積為18μL，混勻。 
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。 
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。 
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。 
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。 
(6)消化后的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。 
(二)Southern Blot及雜交。 
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和后，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。 
1、配液： 
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH 
(2)中和溶液：200mL 20×SSC 
100mL 1mol/L HCL 
100mL 1mol/L Tris HCl pH8.0加水至500mL。 
(3)20×SSC： 在800mlH₂O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。 
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K₃ PO₄ pH7.4 
125mL 20×SSC 
25mL 100×Denhardt’S溶液 
5mL 5mg/mL魚精DNA 
250mL 100%去離子甲酰胺 
82.5mL H2O(總體積為500mL) 
(5)100×Denhardt’S液：10g聚蔗糖(Ficoll400) 
10g聚乙烯吡咯烷硐 
10g牛血清白蛋白(組分V) 
加H2O至500ml 
2、操作步驟(如圖20-1)： 

(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。 
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察并照像，在膠的旁邊放一尺子。 
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動： 
500mL 0.2mol/L HCL 10分鐘，水洗若干次 
500mL變性液中浸泡15分鐘×2 
500mL中和溶液浸泡30分鐘。 
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小于膠3mm。 
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。 
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，并加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時 
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鐘，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。 
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。 
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鐘，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×10⁵ CPM/ML。 
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。 
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜 
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鐘 
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鐘，氣中干燥。 
(12)將雜交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。 
(13)X片顯影、定影，然后讀片 
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交 
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨后將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。 
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K₃PO₄ pH7.4 
125mL 20×SSC 
25mL 100×Danhardt’s液 
5mL 5mg/mL 魚精DNA 
250mL 100%去離子甲酰胺 
加H₂O 至500mL-20℃貯存 
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。 
2、操作步驟： 
(1)RNA變性電泳方法同前 
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分鐘，輕輕搖動。 
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。 
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。 
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。 
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。 
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。 
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鐘 
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鐘 
(9)曝光于X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析 
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合后，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。 
1、配液： 
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 
150mmol/L 甘氨酸 
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 
甲醇，加水至6L 
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S 
1%乙酸 
2、操作步驟（如圖20-2）：

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標準染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。