| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄1。
貯存液稀釋至適當濃度。
細胞裂解緩沖液（~150 ml)
30 mmol/LTris-Cl(pH7.l)
0.1 mmol/LEDTA
20%(m/V)蔗糖
細胞洗滌緩沖液（~250 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)
30 mmol/LNaCl
柱洗脫緩沖液（~100 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/L麥芽糖
柱洗滌緩沖液（~250 ml)
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.1)
1mol/L NaCl
MgCl2(0.1 mmol/L,~250 ml)
PMSF(100mmol/L)
17.4 mgPMSF溶于1 ml異丙醇，-20°C貯存。
PMSF在水洧液中易失活，失活速率隨水溶液pH值的升高而升高，而且在25°C比在4°C失活快。20mmol/LpH8.0的PMSF
水溶液的半衰期是35 min左右（James1978),
這么短的半衰期意味著堿性(pH>8.6)PMSF水溶液在室溫貯存數小時后可以安全丟棄。
可向 Boehringer Mannheim 公司購買 PMSF 替代品（4-[2-氨基乙基]-苯磺酰氟, 鹽酸鹽；Pefabloc SC),Pefabloc 是不可逆絲氨酸蛋白酶抑制劑，使用濃度與 PMSF 相同，但無毒性，而且在水溶液中穩定。
1XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
Tris-Cl(10 mmol/L,pH7.1)
酶和緩沖液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、腸激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和貯存參照生產商手冊。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄 8。
離心機和轉頭
Beckman Ti60 轉頭或相當的轉頭
Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或相當的轉頭
特別配備
直鏈淀粉瓊脂糖
可以參照 Kdlermann 和 Ferenci(1982) 的方法合成，也可以向 New England Bioland 公 SJ 購買（每毫升柱床體積結合 1~4 mg MBP）。
沸水浴
超聲儀器
參見附錄 8。
—次性 Nalgene 濾器（0.45um 硝酸纖維素膜）
載體和細菌菌株
表達 BMP 融合蛋白的大腸桿菌細胞（方案 1 或 2 的步驟 17 所制備的細胞沉淀)。
方法
直鏈淀粉瓊脂糖柱的準備
1.4°C 懸于 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 的直鏈淀粉瓊脂糖裝 3 cmX6 cm 柱。
制備細胞抽提物
2.
細胞沉淀懸于相當于原培養物 1/10 體積（一般為 50 ml) 的冰冷的細胞洗滌緩沖液,4°C 5000 g(5500r/min
Sovall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞沉淀，再懸于相當于原培養物 1/10 體積（一般為 50 ml)
的冰冷的細抱洗滌緩沖液。
3. 制備細胞裂解物
如果所用載體不帶 MBP 信號肽序列（pMAL-c2)
a. 超聲破碎細胞, 功率 30W, 保持細胞低溫（0°C)。
b. 為使溶液澄清，加入 PMSF 至終濃度 1 mmol/L, 于 4°C 以 87000 g(35000r/min Beckman Ti60轉頭）離心 30 min。
繼續步驟 4, 直鏈淀粉瓊脂糖層析從上清中純化融合蛋白。
如果所用載體帶有 MBP 言號肽序列（pMAL-p2)
a.4°C5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞，沉淀懸于相當于原培養物 1/20 體積（一般為 25 ml) 的冰冷的細胞裂解緩沖液。
b. 加入 PMSF 至終濃度 1 mmol/L，室溫攪動 15 min, 于 4°C 以 17200 g(12000r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 10 min 收集細胞。
c. 旋動細胞沉淀，加入冰冷的 0.1 mmol/LMgCl2 溶液（每升培養物加 lOOml),4°C 攬動 10 min。
d. 休克細胞 4°C17200 g(12000r/min Sorvan SS-34 轉頭）離心 10 min, 在上清中加入 lOmmol/L Tris-Cl(pH7.1) 至 pH 達到 7.1。
e. 上清用 100 ml—次性 Nalgene 濾器（0.45um 硝酸纖維素膜）過濾，濾液用 100 倍體積的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)4°C 透析。繼續步驟 4, 直鏈淀粉瓊脂糖層析從上清中純化融合蛋白。
純化融合蛋白
4. 步驟 3 獲得的上清上柱，100 ml10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 漂洗，100 ml 柱洗滌緩沖液沖洗。
5. 用 50 ml 柱洗脫緩沖液洗脫結合的融合蛋白，每份 1 ml 分步收集。
6.SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析融合蛋白的分布，合并含融合蛋白的樣品并貯存于-70°C。
7. 用適當的蛋白酶切割融合蛋白釋放靶蛋白。
a. 加入凝血酶、腸激酶或 Xa 因子（根據融合蛋白中的位點選擇)。每毫升樹脂加入 50 單位的溶于 lmlPBS 的蛋白酶。顛倒離心管數次混勻，室溫下振蕩 2~16 h。用小規模試驗確定獲得最高產量所需時間。
b.4°C 以 500 g(2100r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 5 min, 上清小心轉移到新管中。
用傳統的層析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離靶蛋白和蛋白酶。
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