克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定

熱穩定 DNA 聚合酶 正義和反向引物 DNA 模板

擴增緩沖液 dNTP 貯存液 Tris-Cl

瓊脂糖凝膠 屏蔽型槍頭 沸水浴 離心管 正向排液式移液器 PCR 儀

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

Tris-Cl ( 10 mmol/L，pH 7.6)

2. 酶與緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

正義和反向引物（20 μmol/L) 溶于水中（20 pmol/μl）

DNA 模板

5. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

沸水浴

離心管

正向排液式移液器

PCR 儀

二、方法

篩選單個克隆的細菌菌落或 λ 噬菌斑

1. 對所要篩選的細菌菌落或 λ 噬菌斑進行計數。制備適量的主混合液，每個所要分析的菌落或噬菌斑需要 25 μl 的主混合液，以此主混合液作為模板 DNA，再加入以下試劑，使總體積為 1 ml：

10X 擴增緩沖液                     100 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液  50 μl

正向引物                               1 nmol

反向引物                               1 nmol

H₂O 補足至                           1 ml

2. 從上述主混合液中取 25 μl 至一支擴增離心管（根據實驗需要可設幾個擴增管 )。

3. 用滅菌的 20 μl 槍頭（不用牙簽）挑取一個個的細菌菌落或 λ 噬菌斑，迅速地使挑取物溶在 25 μl 主混合液中。

4. 蓋上離心管的蓋子，細菌菌落在沸水上溫育 10 min，λ 噬菌體在沸水中溫育 2 min。

5. 在樣品管主混合液于沸水上溫育的同時，將 Tag 聚合酶用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6）稀釋至 1 單位/μl；再將這種稀釋酶液在冰浴上保存備用。

6. 將步驟 4 的樣品冷卻至室溫，離心數秒鐘，然后每一管加入 1 μl 稀釋的 Taq DNA 聚合酶。

7. 設置兩支對照管。在一支對照管中加入除了模板 DNA 的所有上述試劑；在另一支對照管設置呈陽性對照管，即加入已分析證實呈陽性的重組 λ 噬菌斑或菌落裂解液作為模板 DNA。陽性對照管的擴增片段應較實驗管的擴增片段更大些為佳。這種較大的陽性對照片段的成功擴增，說明這種穩定 DNA 聚合酶具有擴增多大長度片段的能力。

8. 如果 PCR 儀沒有配備加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl )。將反應管放置 PCR 儀上。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：



9. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠） 或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

這種技術能夠適用于在 96 孔微量滴定板上設計 PCR 進行大量的細菌菌落或 M13 噬菌斑的篩選（Trower 1996)。