RNASI核酸酶作圖

[γ-32P」ATP 合適的寡核苷酸 DNA 模板l 10XdNTP 混合物 KLenow 片段 合適的限 制性內切核酸酶 X 射線膠片 洗脫緩沖液 tRNA 石蠟油 S1 核酸酶

10X 激酶緩沖液 PNK 10X 復性緩沖液 6% 聚丙烯酰胺 8mol L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料 乙酸鈉 4X 雜交緩沖液 去離子甲酰胺 S1 緩沖液 S1 終止緩沖液 異丙醇

垂直電泳裝置   水浴   雜交管   雜交爐

一、材料與設備

1) 垂直電泳裝置

2) 水浴

3) 雜交管

4) 雜交爐

5) 用于從單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針的試劑。①10X 激酶緩沖液:400 mmol/LTris-HCl(pH7.8),100 mmol/LMgCL₂，1OOmmol/L 疏基乙醇，250 ug/ml 牛血淸白蛋白儲存于 -20℃ ②[γ^-32P」ATP(比活度 3000Ci/mmol)③合適的寡核苷酸：溶于蒸餾水，濃度為 l0 pmol/L, 存于 —20℃ ④ PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，濃度為 10 U/ul, 存于 20°C.⑤10X 復性緩沖液：100mmol/LTris-HCl (ph7.5).，l00 mmol/L MgCl₂，500 mnnol/L NaCl，10O mmol/L DTT⑥DNA 模板：l mg/ml  ⑦10XdNTP 混合物：5 mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow 片段：大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的大片段，濃度為 lOU/ul 存于 -20℃,⑨合適的限制性內切核酸酶。⑩6% 聚丙烯酰胺/8mol/L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料。?X 射線膠片：需具有合適的靈敏度.?洗脫緩沖液：50 mmol/L TrisHCl(PH7.5)，0.5 mmol/LEDTA。?3mol/L 乙酸鈉 (pH7.4)?tRNA:10 mg/ml 儲存液，儲存于-20°C

6) 雜交和 S1 分析。①4X 雜交緩沖液：1.6 mmol/LNaCl，40 mmol/LPIPES(pH6.4)。②去離子甲酰胺。③石蠟油。④S1 緩沖液：300 mmol/LNaCl30 mmol/L 乙酸鈉 (pH4.5);4.5 mmol/L 乙酸鋅，⑤S1 核酸酶：濃度為 10U/ul，儲存于-20℃。⑥S1 終止緩沖液：2.5mol/L 乙酸銨,50 mmol/LEDTA⑦異丙醇


二、操作方法

(一）單鏈 DNA 探針的制備

1. 由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針

1) 寡核苷酸探針的標記：在 0.5 ml 離心管屮加入下列組分:

寡桉苷酸                                           1ul

[γ^-32P]ATP                                      10ul

l0x 激酶緩沖液                                  2ul

dH₂O                                                6ul

多核苷酸激酶 1ul

將上述組分混合，于 37℃ 保溫 45 min 以標記寡核苷酸探針，最后于 95℃ 保溫 2 min 以滅活多核苷酸激酶。

2) 加入 2ul 筍鏈 DNA 模板，4ul10X 復性緩沖液，14ulH₂O，依次在 65℃10 min，55℃ lOmin，37℃ lOmin 保溫

3) 加入 4ul NTP 混合物，lul Klenow 片段，室溫作用 10 min 后于 65℃15 min, 滅活Klenow 片段

4) 加入適量的 NaCl 或通過稀釋校正混合物的濃度，加人 20U 限制性內切核酸酶，37℃ 保溫 60 min

5) 加入 2ul tRNA 儲存液 A1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉，3 倍體積的乙醇 5 置于干冰中 10 min，12000 g 離心 15 min 以沉淀樣品

6) 加入 20ul 甲酰胺染料重懸沉淀，于 95℃ 加熱上取樣于 6% 聚丙烯酰胺/尿素凝膠 h, 至溴酚藍達到凝膠底端時結束電泳。

7) 凝膠用 X 射線感光片曝光 5 min，確定單鏈 DNA 片段的位置。切下相應的條帶，置于 500ul 洗脫緩沖液中過夜。

8) 加入 50ul 乙酸鈉 T20ugtRNA,lml 乙醇。置于一 20℃ 中 2 h,12000 g 離心 20 min

9) 將沉淀作放射活性計數后重懸干甲酰胺中按 lO5 cmp/ul), 儲茌于一 20°C。此探針劑吋用于雜交和 S1 分析

2. 從雙鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針

除下列步驟外, 其余步驟均 1「由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針'

1）先用所選的限制性內切核酸酶切割雙鏈質粒（20ug)，沉淀重懸于水中，濃度為 lmg/ml

2) 復性步驟 1「由單鏈 DNA 模板制備笮鏈 DNA 探針」屮第 2) 步需快速進行。加熱滅活多核苷酸激酶后加入 2?5ug 酶切質粒、、4ul10X 復性緩沖液、14ul 水。95°C 保溫 5 min，立即置于冰水屮，然后按步驟由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針」中第 3) 步進行。

3) 省去限制性酶切，即 1「由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針」中第 4) 步。

(二）雜交和 S1 核酸酶分析

1) 于 0.5 mlEppendorf 管中加入下列組分：

探針（共 10000cpm)                                 10ul

4X 雜交緩沖液                                           5ul

RNA(總 poly(A)+RNA 或離體合成的）      5ul

石蠟油 (以防止蒸發）                             20ul

混勻于 37℃ 保溫 4?16 h。

2) 加 200 ul S1 緩沖液 (含 S1 核酸酶 100U)，充分混勻，置于 37°C 中 5?30 min。加入 50 ul S1 終止緩沖液終止反應，并加入 40 ug tRNA，300ul 異丙醇. 置于干冰屮 15 min,12000 g 離心 15 min

3) 用 80% 乙醇洗沉淀物，晾干后重懸于 3ul 甲酰胺染料中，95℃ 加熱 5 min，上樣于6% 聚丙烯酰胺/尿素凝膠，電泳至溴酚藍到達凝膠底端，將凝膠曝光 8?48 h

1) 寡核苷酸長度為 20?25 個核甘酸，并與所分析的 DNA 互補。

2) 單鏈或雙鏈 DNA 模板均按標準方法制備，與雙鏈 DNA 模板制備探針相比，用單鏈 DNA 模板制備探針的優點主要是探針的得率更高，用單鏈模板制備時比活可達 1X106-1.5×106cpm

3) 為提高片段的冋收率，限制性內切核酸酶應于寡核苷酸雜交處 3＇端 200?600 個核酸的位置上進行酶切，更長的片段就難于從丙烯酰胺膠中回收。如果所用的限制性內切核酸酶切割 DNA 模板上的不止一個位點，只要它們位于探針序列以外，就不會有妨礙。

4) 所分析的 RMA 種類不同，雜交時間亦不同. 若用細胞質總 RNA 或 poly(A)+RNA 樣品，成于 37°C 至少雜交 12 h; 而用體外轉錄的 RNA 則雜交 2?4 h.

5) 分析離體轉錄的 RNA 時，S1 核酸酶作用時間町先選擇 15 min、30 min、60 min 三種，這樣可以確定將所有的單鏈核酸，包栝游離的探針，均被完全消化所需的條件，分析細胞質總 RNA 或 Poly(AVRNA 時，S1 核酸酶的最佳消化時間為 30 min，往往比消化離體轉錄的 RNA 所需的時間（15 min) 要長一些。