反轉錄合成單鏈cDNA實驗

RNA RT主體混合液

薄壁PCR管 離心管 熱循環儀

一、材料

1.核酸和寡核苷酸

來自方案2的RNA

為每個單獨的H-T₁₁M引物，分別配制RT主體混合液

蒸餾水                                28.2ul

5XRT緩沖液                       12.0ul

2.5mmol/LdNTP混合液        4.8ul

H-T₁₁M(原文為H-T₁M。一譯者改）

引物（這里M=G、A或C)6.0ul

2.專用設備

0.5ml離心管

0.2ml薄壁PCR管（GenHunterT101)

熱循環儀[推薦使用GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-ElmerCorporation,Norwalk，CT)或者Mastercycler(EppendorfScientific，Westbury，NY)]

3.附加試劑

RNAspectraFluorescentmRNA差異顯示系統（GenHunterF501-F510R501-R510)，包括蒸餾水、5XRT緩沖液[125mmol/LTris-HCl、pH8.3，188mmol/LKCl,7.5mmol/LMgCl₂,25mmol/L二硫蘇糖醇（DTT)]、FDDdNTP混合液(2.5mmol/L)、錨定引物（H-T11M)(2umol/U以及MMLV逆轉錄酶（100U/ul)

二、方法

cDNA合成

1.按照下面步驟，配制3個反應管（為3種H-T₁₁M引物各準備一個）。
各取42.5ulRT主體混合液，加到標記好的、無RNA酶的0.2ml薄壁PCR管中。記住要為所用的每個錨定引物（H-T₁₁M)準備單獨的RT反應！

2.用DEPC處理過的H20,將RNA稀釋到終濃度并充分混勻，置于冰上。

3.取5.0ul稀釋的RNA(0.1ug/ul),加到0.5ml管子中，并充分混勻。

4.按照下面程序設置熱循環儀：65°C 5min→37°C 60min→75°C 5min →4°C平衡。

5.將反應管放到熱循環儀中，開始程序。

6.當反應進行到37°C10min時，暫停熱循環儀，在每個管中加入2.5ulMMLV逆轉錄酶，迅速混勻后繼續溫育。

7.反轉錄結束后，最高轉速短暫離心，收集冷凝水。

8.將反應管放在冰上或-20°C備用。