體細胞雜交實驗

匯合至一定程度的受體細胞

受體細胞適合生存的培養基 合適的選擇性試劑 含感興趣染色體及合適遺傳標記的供體細胞

10 cm 組織培養板 25 cm 組織培養瓶 倒置相差顯微鏡

基本方案 單層全細胞融合

1.倘若不知道細胞的選擇條件，通過以下方式來確定：將培養于 25 cm 培養瓶中的受體細胞傳代，比例為 10:1，分裝于不同培養瓶中，并用不同水平的選擇試劑來培養。

每周 2 次觀察細胞，換液，10d 之后確定抑制細胞生長的試劑的最低濃度。

2.在融合前的當天下午，將等量的供體細胞和受體細胞（通常為 5X105?IXlO6 個) 培養于含 IOml 有血清的培養基中，同時分別將供體細胞和受體細胞培養于含或不含 PEG 的培養基來做對照，培養過夜。

供體和受體細胞在選擇條件下需死亡，含 PEG 的細胞應該在選擇條件下恢復并開始匯合，當一個新細胞系或新的 PEG 使用時，后者的對照需重故。

3.在顯微鏡下觀察細胞，其需 70% 匯合，細胞與細胞之間需接觸良好，但互不擠壓，若細胞量不夠，準備新培養瓶增加培養。

4.將瓶中的培養基吸出，用無血清的培基洗 2 次，并完全將其吸出，將瓶傾斜一段時間同時將最后的培養基吸出。

5.加 2 ml50%PEG 溶液，37°C。將培養瓶來回傾斜使溶液在細胞中快速混勻，讓其站立 2 min(時間非常重要），若有必要，通過以下試驗來優化條件：peg 濃度為 44%~50%; 單層細胞孵育 2~3 min, 懸浮細胞 2~4 min。

6.將 10 ml 無血清培基輕柔地從皿的一邊加人，輕柔顛倒使 PEG 擴散完全，吸出培基并棄去，用無血清培養基重復洗兩次，最后一次用 10 ml 有血清培養基洗，由于細胞膜此時非常脆弱，故以上操作均需輕柔。

7.加人 10 ml 有血清培養基，孵育 36~48 h(在該時間段內使細胞擴增 2 次）。

8.用胰酶消化細胞，將其分至 5~10 個 10 cm 培養板中。為了確保選擇，板中的細胞濃度需低，以保證細胞在匯合之前能分裂幾次。在每個板中加入 10 ml 有血清培養基和合適濃度的選擇性試劑（第 1 步），在 37°C 中孵育。

9.每 5d 換一次液直至長出克隆，換了選擇性培基后 10?14d 后確認皿中是否有克隆長出。避免損壞細胞或使其長得越來越大，因為移動細胞可能使其長出姐妹克隆。

10.用挑克隆的針將克隆挑出（支持方案 1)。

11.為了避免維持和擴增不需要的細胞系，一旦克隆長出，立即擴增、鑒定（第 3~5 步）及凍存（附錄 31)。為避免染色體缺失和重組，傳代需少（三代以內細胞使用一個凍存管，1 個 6 cm 培養皿使用 2 個凍存管）。在鑒定細胞系時，需使用多種鑒定方法，在復蘇和擴增時需重新鑒定以確保無染色體重組和分離。若有必要，對已分離出額外染色體的細胞系挑亞克隆（支持方案 2)12. 在快速復蘇時，將細胞培養至 25 cm 組織培養瓶中，若細胞在凍存后恢復較慢，則增加凍存培養基中的血清含量。

備選方案 懸浮培養供體細胞-單層的供體細胞的全細胞融合

1.消化貼壁生長的受體細胞，在培基中重懸，用血細胞計數器對供體細胞和受體細胞計數，分別取 2XIO 6 個，在 15 ml 扣蓋的聚丙烯試管中混勻，維持以確保選擇有效。

2.室溫 400 g 離心 5 min，在受體細胞中加入 IOml 無血清的培基，再次離心，小心吸出培養基，將試管傾斜以吸干培養基。

3.輕彈試管使團塊松散。用移液器吸取 0.3 ml 50% PEG 溶液，37°C，沿管壁加人同時輕搖或輕彈試混勻。室溫孵育 3 min。如有必要，可以優化融合條件（基本方案，第 5 步）

4.加入 8 ml 無血清培養基，立即 400g 離心 5 min。

5.小心吸出培養基，再用 IOml 無血清培養基重懸細胞。再次離心。室溫下，吸出培養基，用 IOml 血清培養基重懸細胞。洗的過程中要格外小心，因為此時細胞的膜很脆弱。

6.加 3 ml 細胞懸液到每個 IOOmm 組織培養板內。加 ImI 細胞懸液到另一 100 mm 培養板內，作為對照。孵育 36~48 h。

7.用加血清和篩選因子的培養基培養細胞（用未加篩選因子作對照）。

8.準備克隆及其鑒定（基本方案，第 9~12 步）