實時熒光PCR檢測技術
眾所周知，PCR（聚合酶鏈反應）技術自從1985年問世以來，經過十幾年的發展，已成為實驗室的常規技術。它是現代分子生物學研究中不可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統。相比于傳統的臨床診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術，可以彌補傳統臨床診斷方法的某些缺陷，比如，核酸診斷能直接揭示病原體的存在，能客觀反映病原體在人體內感染及活動情況，可以作為臨床治療中的一個有效監控手段，另外采用核酸診斷技術還可以檢測到常規檢測方法難以檢測到的病原體，例如可以克服酶免檢測技術中從感染到抗體產生的窗口期問題。因此，以PCR技術為代表的核酸診斷技術在臨床診斷中得到日益廣泛的應用。
傳統的PCR檢測模式
傳統的PCR檢測模式一般需要三個步驟：1.首先需要對待測標本進行處理：通過裂解、純化，提取標本中的病原體核酸（DNA或RNA）作為PCR擴增的模板；2. 采用PCR或RT-PCR技術對提取到的病原體核酸進行擴增；3.檢測PCR擴增產物，檢測方法包括凝膠電泳和類似于酶免反應的PCR-ELISA等。
實時熒光PCR檢測技術
近年來，PCR技術有了重大改進。將傳統PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相結合（即在同一個密閉容器中將PCR擴增反應與熒光標記探針檢測結合在一起）檢測目的核酸的檢驗方法紛紛出臺。這樣的檢測方法稱為“實時”PCR，表示PCR擴增產物可被實時檢測。準確地說，“實時”是指在每一個PCR循環后檢測擴增產物，當PCR擴增反應結束后，我們可以得到每個樣品的PCR擴增產物變化曲線。通過分析這些反應曲線，不但可以得到病原體的定性檢測結果，還可以對病原體的數量進行精確定量。
實時熒光PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于應用了熒光探針，可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性，克服了常規PCR的許多缺點。如一般PCR產物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色紫外光觀察結果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給污染和假陽性提供了機會。而實時熒光-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規PCR操作中的諸多弊端從而可以快速以及動態地檢測PCR擴增產物并減少外來核酸造成的污染。
實時熒光PCR技術基于熒光共振能量遷移（FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer）原理：當兩個熒光基團靠近時，高能量熒光基團會將受激發產生的能量轉移到相臨的低能量熒光基團上。由于標記在探針上的兩種熒光基團所發出熒光信號的變化可以反映PCR擴增產物的數量變化，從而使得熒光PCR技術可以起到實時檢測的目的。目前，根據熒光基團在寡核苷酸探針上的不同標記形式，各種熒光PCR檢測試劑盒所采用的熒光探針基本可以分為三種類型：Taqman探針、分子信標和熒光雜交探針
表1: Taqman探針、分子信標和熒光雜交探針的特點比較
熒光探針類型 Taqman探針 分子信標 熒光雜交探針
探針形式 單條探針 1條具有發夾結構的探針 2條相臨的探針
熒光標記 5’端標記發光基團 5’端標記發光基團 1條探針的3’端標記激發基團
3’端標記淬滅基團 3’端標記淬滅基團 相臨探針的5’端標記發光基團
熒光檢測原理 PCR反應延伸時，探針被Taq酶切斷，檢測脫離于淬滅基團控制的發光基團所發出的熒光信號 探針和模板結合，發夾結構被打開，檢測遠離淬滅基團控制的發光基團所發出的熒光信號 2條相臨的探針同時和摸板結合，檢測發光基團受相臨的激發基團激發而產生的熒光信號
常用發光基團 FAM，TET，VIC，HEX FAM Texas Red LC-Red640， LC-Red705
采用實時熒光PCR技術需要具備集PCR擴增和熒光檢測于一體的熒光PCR擴增儀, 目前臨床中普遍使用的熒光PCR儀主要有ABI公司的5700型熒光PCR儀、Roche公司的LightCycler和BioRad公司的iCycler。三種儀器的特點比較見表2。
表2 ：三種熒光PCR儀的特點比較
熒光PCR儀 5700 LightCycler iCycler
可檢測熒光信號 單波長 3種波長 1-4種波長
樣品數 96 32 96
PCR反應時間 2-3小時 30分鐘 1-2小時
在線觀察 不可以 可以 可以
熒光探針形式 Taqman 探針 Taqman 探針 分子信標
熒光雜交探針 Taqman 探針 分子信標 熒光雜交探針
實時熒光PCR檢測技術的優勢
與普通PCR模式相比，實時熒光PCR具備幾個方面的優勢：
1、 由于實時熒光PCR采用封閉的檢測模式，因此擴增產物導致污染的可能性比普通PCR要小得多。
2、 由于擴增產物的檢測在PCR擴增過程中同時進行，并且數據的采集、分析全部由儀器自動完成，因此整個檢測所需的時間比普通PCR要節省許多。
3、 實時熒光PCR檢測模式功能強大，具備定性、定量、突變、多項目等檢測功能。而普通PCR要完成上述項目需采用不同的技術平臺。
4、 實時熒光PCR進行定量檢測時，其定量線性范圍（5-6 logs）比普通PCR（2-3 logs）要寬得多。
隨著反應試劑、儀器和操作的不斷發展和完善，以實時熒光PCR技術為核心的檢測試劑盒紛紛問世，逐步趨向于靈敏特異、快速精確和自動化。當然，由于成本較高，操作難度大，目前在臨床疾病的診斷和治療上還未得到普及。因此，如何進一步提高檢測方法靈敏度、簡化操作程序、縮短檢測時間、消除非特異因素干擾以及采用統一的、標準化的方法已成為實時熒光PCR檢測試劑盒未來研究的主要方向。許多研究者趨向于將更多的精力投入實時熒光定量PCR方法的研究開發，使之進一步合理化，以增加試驗的可信度；通過使其涉及的所有過程實現最終自動化，來提高臨床檢驗結果的準確性。毫無疑問，在不久的將來，實時熒光定量PCR技術將以其顯著的優勢，在分子生物學、實驗醫學，特別是在臨床醫學領域中得到越來越廣泛的應用。