飼養層的準備

第二代13天胎齡小鼠胚胎成纖維細胞 絲裂霉素C

克隆培養用培養基 X射線或6GCo源

1. 用胰蛋白酶消化原代培養的胚胎成纖維細胞（見方案 12.6、方案 13.2），以每毫升 10⁵ 個細胞再種入培養瓶中。

2. 用以下其中之一的方法阻止進一步分裂：



(a)通過放射處理

i)原培養瓶中，細胞暴露于 60 Gy 照射細胞，用 X-光機或 γ 射線源 如 ⁶⁰Co（X 射線或 ⁶⁰Co源，能在 30 min 或更短時間內釋放 30 Gy （可以取代絲裂霉素C））。

ii)消化后細胞懸液，細胞暴露于 60 Gy 照射細胞，用 X-光機或 γ 射線源 如 ⁶⁰Co。然后以 1×10⁵ ml 接種，或將照射過的細胞保存在 4°C，最長到 5 天。

(b)通過絲裂霉素 C （絲裂霉素C，100 μg/ml 儲存液，溶于 HBSS 或無血清培養基中）處理

i)以 0.25 μg/ml 將絲裂霉素加到接近匯合的細胞中，37°C 過夜（~18 h ）[ Macpherson and Bryden，1971 ]，更換培養基。

ii)胰蛋白酶消化懸液 1×10⁷ ml 中加人絲裂霉素 C，終濃度 20 μg/ml（相當于2 μg/10⁶ 個細胞），37°C 孵育 1 h ，離心清洗（4×10 ml） 去除絲裂霉素，再以 1×10⁵ /ml 接種 [Stanley，2002 ] 或 4°C 保存，可到 5 天。

3. 再培養 24~72 h 后，胰蛋白酶消化，再接種在新的培養基中。或直接接種保存的細胞。接種濃度 5×10⁴ 個細胞 /m l （10⁴ 個細胞 /cm²）。

4. 繼續培養 24~48 h，種入克隆培養的細胞。