FFPE組織樣品的DNA和RNA純化

福爾馬林固定后石蠟包埋的組織簡稱為FFPE樣品。

將組織在 4–10% 的福爾馬林中迅速固定。 固定時間限制在 14–24 小時 (越長的固定時間將越容易導致DNA的片段化，對下游實驗不利)。將固定組織徹底脫水 (徹底脫去福爾馬林殘余，因為其阻礙蛋白酶K的作用)。
純化DNA時，使用新鮮從石蠟塊上切下的組織，每次制備最大量：. 每片10 μm. 最多 8 片, 每片大約 250 mm2, 如果對樣品總量和產量沒有把握，建議用2-3 片樣品進行一次預實驗。

QIAamp DNA FFPE Tissue FFPE組織樣品DNA操作流程

■ 去除石蠟：融解于二甲苯并去除

■ 裂解：在變性條件下和 proteinase K 孵育

■ 加熱90°C ：逆轉交聯

■ 結合上柱：合適的溶液環境下，DNA 結合上硅膠膜柱

■ 洗滌： 洗滌殘留污染物

■ 洗脫：純化并濃縮的DNA

試劑盒中溶液配方和含量New Elution Buffer ATE (調節到較高的pH, 與PCR 酶的通適性更強）

FFPE樣品 RNA 和 miRNA 純化原理簡述：

經福爾馬林固定的組織會引起RNA-RNA和RNA-蛋白交聯，這些會影響RNA在下游應用中的表現。miRNeasy FFPE Kit提供特有的裂解液和孵育條件，逆轉福爾馬林對DNA造成的修飾。由此可確保抽提所得RNA在包括real-time RT-PCR等一系列下游應用中最優的表現。獨特的裂解緩沖夜可將RNA從組織切片中有效釋放出來，同時避免RNA進一步的講解。該試劑盒也應用gDNA 去除柱有效去除基因組。經優化的結合條件可確保純化大約18 nt以上的RNA。RNA產量和表現都優于 其他miRNA純化方法，如苯酚-氯仿抽提法。

操作過程：

整個miRNeasy FFPE過程可在70分鐘內完成。經優化的裂解緩沖夜可確保在15分鐘內應用蛋白酶 K 裂解樣本，不影響RNA產量。裂解之后，在80oC條件下孵育樣本15分鐘，逆轉福爾馬林交聯。然后應用gDNA去除柱快速去除基因組 DNA，應用 RNeasy MinElute spin columns純化濃縮的RNA。由于RNA僅洗脫至14-30 μl，下游應用中的反應體積可更小 。

各種文獻對于RNA純化的經驗總結：

1、獲得樣品后，盡快開始固定。

2、將樣本切薄再浸泡 (如果能到 5mm 或更薄最好)。

3、避免過度固定，浸泡時間過長。

4、RNA 純化要包括逆轉膠聯的步驟。QIAGEN的試劑盒中的步驟正滿足這樣的建議。

5、純化的樣品最好是固定或者包埋時間在半年內的樣本。放置時間越長，對于RNA純化越不利。

在后續逆轉錄反應中，使用隨機引物或者混合物而不是僅僅使用oligo-dT。設計逆轉錄PCR時，注意擴增子的片段長度不要過長。

Figure 1. Recovery of small RNA fragments from FFPE tissues. Agilent bioanalyzer analysis was carried out on RNA purifed from
RNAlater stabilized tissues (RNAlater), FFPE tissues stored for 1 year (FFPE 1 year), or FFPE tissues stored for 1 week (FFPE 1 week).

RNA was successfully purified from both the 1-week-old and 1-year-old FFPE tissues, including partially degraded small RNA fragments (Figure 1). Significant degradation of RNA in the FFPE tissues occurred after 1 year of storage, as demonstrated by the reduced size of the RNA and disappearance of the rRNA double peaks in the Agilent bioanalyzer traces. RNA purified from all tissues yielded A260/A280 ratios* of around 2.0, an indication of high purity.

RNA preparation: RNA was purified from the tissue samples after 1 week or 1 year of storage. For the FFPE tissues, RNA was purified from 1–4 sections of 10 μm thickness using the RNeasy FFPE Kit.

Sections were cut on a standard microtome and the first 2 sections were discarded to exclude the effects of air exposure. For the RNAlater stabilized tissues, RNA was purified using the RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. RNA was quantitated by measuring absorbance at 260 nm on a NanoDrop? spectrophotometer. RNA quality was assessed on an Agilent? bioanalyzer in “Eukaryotic Total RNA Nano” mode.