細菌染色技術（單染技術與革蘭氏染色）

細菌  個體微小，普通光學顯微鏡下不易直接觀察，故常用染色技術使細菌細胞著色。包括細菌單染技術、細菌的革蘭氏染色技術、細菌的芽孢染色技術、細菌的莢膜染色技術和細菌的鞭毛染色技術

Ⅰ、細菌的單染技術
簡單染色通常只用一種染色劑，使細菌整個細胞染上顏色。但看不清結構。所以只便于檢查細菌的形態、大小和排列方式等。
【實驗目的】
1、掌握單染色的操作技術
2、觀察細菌的基本形態
【實驗原理】
單染色即用單純的種染料進行染色，多數采用美藍、結晶紫或石碳酸復紅等堿性染料。此法僅能顯示細胞的外部形態，而不能辨別其內部結構。染色前必須將細胞固定，其目的是殺死細菌，并使它粘附在載玻片上。此外，還可以增加菌體對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。無論用哪種方法都應盡量使細菌維持原有的形態，防止細胞膨脹或收縮。
【實驗材料、藥品及器具】
1、菌種 大腸桿菌  （Escherichia coli）
枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）
2、染色液 石炭酸品紅染色或結晶紫染色液（Stining Solutions）
3、無菌水
4、洗瓶裝蒸餾水
5、洗凈的載玻片（Slicle）5片
6、顯微鏡、香柏油、接種環、酒精燈、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯
【實驗步驟】
1、涂片：取一片干凈無油載玻片，在其中央滴一滴無菌水，然后用接種環以無菌操作方法取少許培養好的大腸桿菌，放在載玻片的水滴中涂勻，注意菌量不宜過多，否則，不易看清單個菌體。
2、固定：將涂好的玻片在空氣中風干或火焰上通過3～4 次，使水份蒸發，此時細菌菌體緊貼在玻片上。
3、染色：用石炭酸品紅或結晶紫染色劑30~60S，然后用洗瓶輕輕沖洗染色劑（注意不要直接沖洗染色部位），直至無多余的染液，晾干或用吸水紙從旁吸干或用微火烘干。
4、用同樣方法將枯草芽孢桿菌制作一張涂片。
5、鏡檢：首先在低倍鏡下找到物像，然后在涂膜中央滴一滴香柏油，換成油浸鏡觀察兩個菌種的形態和排列。
6、去除油鏡上的香柏油：先用干凈的擦鏡紙擦2-3 次，再換另一張擦鏡紙蘸取少許二甲苯以除去殘留的香柏油，最后用擦鏡紙擦干。擦鏡頭時應順著鏡頭直徑方向擦，不要沿著圓周方向擦。
【實驗結果】
1、繪制觀察到大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的形態圖，并注明放大倍數。
2、用文字描述兩菌株的細胞形態。
【思考題】
1、涂片在染色前為什么要先進行固定？固定時應注意什么問題？
2、制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？
3、制片時應注意哪些事項？為什么？

Ⅱ、細菌的革蘭氏染色
革蘭氏染色是細菌鑒定上一個最重要和廣泛應用的方法。根據此法染色結果可將細菌分成兩大類。一類細菌能夠保留初染色劑（結晶等）于細胞中，不受脫色劑（酒精）的影響，而最后細菌被染成紫色或深藍色者稱為革蘭氏陽性（Gram-positive）；另一類細菌可因脫色劑的作用而洗出結晶紫，然后被另一染色劑（藏紅花）染成紅色，稱為革蘭氏陰性（Gram-negative）。也有一些菌種革蘭氏染色是可變的。
【實驗目的】
了解革蘭氏染色的原理，并掌握革蘭氏染色法的操作技術。
【實驗原理】
革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884 年由丹麥醫師Gram創立。
細菌先經堿性染料結晶紫染色，再經碘液媒染（以增加染料與細胞的親和力）后，用酒精或丙酮脫色，再用復染色劑染色。不被脫色而保持原顏色者為革蘭紙陽性菌（G+）；被脫色后又被染上復染劑的顏色者為革蘭氏陽性菌（G-）。此法可將細菌分為兩大類。
革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用乙醇或丙酮脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染液的顏色；而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多且交聯度大，類脂質含量少，經乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此，細胞仍保留初染時的顏色。
【實驗材料、藥品及器具】
1、菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）
枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）
金黃色葡萄球菌（Staphylococeus auresu）
2、染液 草酸銨結晶紫液
革蘭氏碘液
95%的酒精
藏花紅液
3、器皿洗凈的載玻片6 片、顯微鏡、酒精燈、接種環、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、鑷子、玻璃缸、瓶裝蒸餾水
【實驗步驟】
1、取培養12-24h的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別涂片、固定。
2、加草酸銨結晶紫染色劑一滴，染色1 分鐘。
3、傾去染液并用洗瓶裝水輕輕沖洗。