實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
|---|---|
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 在選好植物材料和勻漿緩沖液后，接下來關鍵的因素包括勻漿方法、緩沖液的 pH、使用的緩沖液與植物組織之間的比例、研磨時間及溫度等（見注釋 5) 。 3.1 勻漿 根據植物組織的不同可以采取不同的勻漿方法，或者幾種勻漿法結合運用。 ( 1 ) 直接用預冷的研缽和研槌進行勻漿。 ( 2 ) 在燒杯中用 Moulinex 混合器勻漿 20~60s，或者用 Polytron 攪拌器在 50% 的全速下攪拌 5 次，每次 2s。 ( 3 ) 在陶瓷攪拌器中高速下攪拌 15s，或低速下攪拌 2 次，每次 15s。 ( 4 ) 用商用蔬菜或水果榨汁機將塊莖直接榨汁到 5X 勻漿緩沖液中。 ( 5 ) 直接用搓板在勻漿緩沖液中將材料搓碎。  3.2 緩沖液 pH 以及與材料的比例 ( 1 ) 使用前勻漿緩沖液的 pH 必須調到 7.8 左右，以確保在細胞破碎后的整個系統 pH 仍能保持在 7.0~7.6。 ( 2 ) 對于某些特殊的植物組織，可能需要使用較多的勻漿緩沖液或者勻漿后使用 5 mol/L KOH 或 NaOH 調節以保證最后的 pH 在 7.0 以上。 ( 3 ) —般來講，鮮重每克非綠色組織需用 2 ml 勻漿緩沖液，每克綠色組織則需用 4 ml。降低緩沖液的使用量會大大降低線粒體的提取效率。 ( 4 ) 在從塊莖組織中提取線粒體時，使用較少的緩沖液也能有較高的提取效率，可能是因為該組織中酸類化合物含量較低的原因。 3.3 過濾及差速離心獲得細胞器粗提物 ( 1 ) 勻漿液必須經過 4 層紗布在漏斗上過濾到燒杯或錐形瓶中，殘留在紗布中的勻漿液可以直接擰到濾液中。過濾必須在 4~10°C 條件下進行。 ( 2 ) 將濾液轉移到預冷的離心管中（體積依濾液的多少而定，可以是 50 ml、250 ml 甚至 500 ml) ，然后在 1500 g 下用固定轉角的轉頭離心 5 min。轉頭需預冷至 4°C。 ( 3 ) 所得沉淀為淀粉粒、核及細胞碎片。將上清液小心轉移至新的離心管中，然后 18000 g 離心 15 min。高速離心所得粽褐色或黃色或綠色沉淀即為含有各種細胞器的粗提物。 ( 4 ) 用 5~10 ml 標準清洗液 [ 如 0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH、pH 7.2 和 0.1% ( m/V ) BSA ] 將細胞器粗提物重新懸浮。如果勻漿緩沖液中所用滲透介質為蔗糖，則 0.3 mol/L 甘露醇應改為 0.3 mol/L 蔗糖。 ( 5 ) 將重新懸浮的液體轉移至 50 ml 的離心管中，用清洗液調整體積至 40 ml 后 1000 g 下離心 5 min。 ( 6 ) 上清液轉移至新的離心管中，18000 g 離心 15 min。去掉上清液，沉淀用小量體積的清洗液重新懸浮均勻（見注釋 6)。 3.4 密度梯度離心純化線粒體 經上述步驟所得的線粒體可以用來進行呼吸效率的測定。但是根據其組織來源的不同，所得的線粒體常常混有類囊體或淀粉體膜、過氧化物酶體、乙二酸循環體、內質網及細菌，需要經過 Percoll 密度梯度離心進一步純化。 ( 1 ) 將清洗過的線粒體溶液注入到 Percoll 梯度的表面，一般從 80 g 黃化植物組織或 40 g 綠色植物組織中提取的線粒體用 35 ml Percoll 梯度溶液，使用 50 ml 的離心管進行離心（見注釋 2) 。 ( 2 ) 35000 g 離心 45 min，使用轉角轉頭，降速時不設置「 brake」減速。 ( 3 ) 離心后，線粒體呈淺黃色條帶，位于綠色的葉綠體或黃色的質體膜條帶之下 ( 圖 7-2)。用巴斯德吸管將線粒體部分吸出后（避免吸入質體）用 4 倍體積的標準清洗液稀釋，然后 18000 g 離心 15 min。  ( 4 ) 所得松軟沉淀可再次用清洗液懸浮，并在同樣速度下離心 15 min。最后所得線粒體沉淀可按 5~20 mg 線粒體蛋白/ml 清洗液（可用 Bradford 或 Lowry 法定量）重新懸浮溶解。 3.5 純度鑒定 可以通過各種細胞器標志性酶的活性來確定線粒體的污染程度。過氧化物酶體可以鑒定過氧化氫酶、羥基丙酮酸還原酶或者乙二醇氧化酶的活性；葉綠體可以用葉綠素含量，白色體可以用類胡蘿卜素的含量或堿性焦磷酸酶的活性；乙二醛循環體可以用異檸檬酸裂解酶的活性；內質網可以用對抗霉素 A 不敏感的細胞色素 C 還原酶；質膜可以用 K+/ATPase 活性等來確定各種細胞器對線粒體的污染程度。經過仔細地密度梯度離心后，一般來自胞質的污染比較少，即使有污染，也可以通過測定乙醇脫氫酶的活性來確定。有關各種標志酶活性的測定方法可以參考文獻 [ 1 ] 和文獻 [7]。其他線粒體純度相關事項可以參考注釋 7。 3.6 線粒體完整性鑒定 分離出的線粒體可以通過各種方法來確定其結構的完整性。外膜的完整性通過其對外源細胞色素 C 的不通透性來確定。施加非離子變性劑（0.05% m/V Triton X-100 ) 前后細胞色素 C 氧化酶活性的比值可以用來衡量線粒體的破裂比例。以下介紹兩種經典且簡單易行的酶活測定方法。 1. 氧氣消耗速率 在一個細胞色素 C 可再生系統（保證穩定的底物濃度）中，使用氧電極即可測得氧氣的消耗速率。 ( 1 ) 在 20 mmol/L 抗壞血酸中先測定氧氣的消耗速率，然后在 25 μmol/L 細胞色素 C 中測定氧氣的消耗速率，接著加入 Triton X-100 ( 0.05% ) 后測定氧氣消耗速率，最后加入 1 mmol/L KCN 停止反應。 ( 2 ) 細胞色素 C 氧化酶活性定義為在細胞色素 C 和 Triton 存在條件下氧氣的消耗速率減去加入 KCN 后的消耗速率（加入 KCN 后的氧氣消耗速率通常和僅有抗壞血酸條件下測定的氧氣消耗速率相同）。 ( 3 ) 沒加 Triton 前所得的酶活與加入 Triton 后所得的酶活的比值即可衡量線粒體破裂的比例。 2. 還原型細胞色素 C 的氧化 用分光光度計測量反應體系在 550 nm 下吸光值的變化可以測定還原型細胞色素 C 的氧化程度。 ( 1 ) 將線粒體蛋白加入到反應體系中（0.1 mol/L Tris-HCl、25 μmol/L 還原型細胞色素 C) ，在 550 nm 下測定吸光值的變化速率，然后加入 0.05% Triton X-100 繼續測定吸光值的變化速率。最后加入 1 mmol/L KCN 停止反應。 ( 2 ) 細胞色素 C 氧化酶的活性定義為在加入 KCN 之前的速率減去加入 KCN 之后的速率。 ( 3 ) 同樣沒加 Triton 前所得的酶活與加入 Triton 后所得的酶活的比值即可衡量線粒體破裂的比例。 3.7 線粒體的貯存 制備的線粒體可以在冰上保存 5~6 h 后仍然保持膜的完整性和呼吸活性。長期保存可以在加入 DMSO ( 終濃度或乙二醇（7.5% V/V ) 后用液氮迅速冷凍保存于 -80°C 數月。 3.8 線粒體各組分的分級分離 采用滲透脅迫加差速離心的方法可以將植物線粒體分級分離為 4 個組分：線粒體基質（MA)、膜間隙（IMS )、內膜（IM ) 及外膜（OM) 。 ( 1 ) 開始分級分離前，將線粒體樣品鹽洗一遍以去除一些非特異性結合在線粒體外膜的蛋白質：將 5~10 mg 線粒體沉淀懸浮在 4 ml 清洗液（不含 BSA ) 中，加入 2 mol/L KCl 至終濃度為 200 mmol/L。分裝在 2 個 2 ml 的離心管中，20000 g、4°C 離心 15 min。 ( 2 ) 小心去掉上清液。用低滲緩沖溶液重新懸浮沉淀，并定量至 6 ml 后轉移到 10 ml 的錐形瓶中，冰浴上攪拌 15 min ( 見注釋 8) 。這一步操作使得線粒體膨脹，導致外膜破裂。也可以外加一定的機械剪切力（如用微量玻璃勻漿器）來增加對外膜的破碎。 ( 3 ) 向處理過的樣品中添加 0.9 ml 2 mol/L 的蔗糖（約為 1/8 倍稀釋蔗糖）后分裝到 2 ml 的離心管中，20000 g，4°C 離心 15 min。 ( 4 ) 小心收取上清液（包含外膜小泡和膜間隙蛋白）凍存于 -80°C。 ( 5 ) 去掉殘存的上清液，然后將沉淀（mitopksts) 重新懸浮在 2 ml 250 mmol/L 的 KCl 溶液中，20000 g，4°C 離心 15 min。 ( 6 ) 去除所有上清液，沉淀用 0.5~1 ml 雙蒸水溶解后在微量勻漿器中研磨約 5 min 以破碎沉淀。 ( 7 ) 勻漿液定容至 4 ml 后分裝至 2 個 2 ml 的離心管中 20000 g，4°C 離心 15 min。 ( 8 ) 小心收取上清液（包含基質蛋白），于 -80°C 凍存。 ( 9 ) 沉淀部分包括線粒體內膜和未破碎的沉淀。將沉淀溶于 4 ml 雙蒸水中，液氮下反復凍融 2 次或 3 次。20000 g、4°C 離心 15 min。收取沉淀即為內膜部分。也可以用 100 mmol/L Na2CO3 清洗內膜部分以富集膜內在蛋白。 ( 10 ) 分離外膜以及膜間隙蛋白組分，以及從基質（MA) 中去除污染的膜成分需要使用超速離心。將貯存在 -80°C 的基質以及外膜與膜間隙組分在 4°C 融解后 100000 g 4℃ 離心 1 h。對于外膜與膜間隙組分，上清液即為膜間隙蛋白質，沉淀即為外膜部分；對于基質組分，上清液即為純的基質蛋白質溶液。各部分可以重新冷凍保存。 （11 ) 樣品純度通過測定各組分的標志性酶活性即可判定。內膜：細胞色素氧化酶（COX)；基質：延胡索酸酶；膜間隙：肌激酶；外膜：抗生素 A 不敏感的 NADH 細胞色素 C 氧化還原酶 。也可以用抗體識別各標志性酶的反應來確定各組分的純度。各組分蛋白質在 SDS-PAGE 膠上顯示出不同的條帶分布特征（圖 7-3)。  |
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