結核分枝桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

【摘要】  目的 建立結核分枝桿菌的熒光定量PCR檢測方法，探討熒光 PCR檢測痰標本中結核分枝桿菌的應用價值。方法 根據結核分枝桿菌基因保守序列設計引物和探針，并構建標準品。對102例培養涂陽的結核痰液標本和45例非結核感染者的痰標本，應用熒光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法檢測結核分枝桿菌。結果 熒光定量 PCR、抗酸染色法檢測結核分枝桿菌的特異性分別為100%、30%。結論 熒光定量PCR是一種快速、敏感性高、特異性強的結核分枝桿菌輔助診斷方法，具有重要的應用價值。

       【關鍵詞】  結核；分枝桿菌；抗酸染色；熒光定量PCR

       結核病是嚴重危及全球的公共衛生問題之一，自1985年以來結核病疫情在全球范圍內急劇上升，據世界衛生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結核桿菌，即20億人口感染了結核桿菌，其中活動性肺結核病人約2 000萬，每年新增結核病人約800～1 000萬，每年約有300萬人死于結核病［1～3］。結核病已成為導致全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。我國是全球22個結核病高發國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。據2000年全國結核病流行病學抽樣調查估計，全國現有活動性肺結核病人450萬，其中傳染性肺結核病人150萬［4］。結核病防治是我國乃至全球疾病防治的重要課題。目前，出入境人員體檢診斷傳染性肺結核的主要方法是通過胸部X片檢查，加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPD試驗聯合檢測。由于胸部X片是根據臨床癥狀進行診斷，缺乏病原學依據，加上肺結核與其他肺部疾病在胸片上有相似的地方，容易出現誤診和漏診；痰涂片抗酸染色的陽性率低，采樣不合格標本的陽性率更低，極易出現漏診；而PPD試驗的特異性不強，不能作為確診肺結核的依據。因此，這三種檢測方法的組合模式在檢測肺結核上存在著較大的缺陷，易導致傳染性肺結核病人的漏診，而少數肺部疾病或其他部位結核的病人可能出現誤診，降低了出入境人員傳染性肺結核監測的效果。分子生物學方法以其簡便、快速，特異性高的特點成為結核分枝桿菌檢測研究的熱點。國內外大量研究證明PCR檢測結核分枝桿菌敏感性達到100％，本研究以熒光PCR技術為基礎，開發適合傳染性肺結核快速診斷模式，結果報告如下。

       1、材料與方法

       1.1  材料

       確診肺結核病人培養涂陽的結核痰液標本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標本共計20份。

       1.2  引物與探針

       根據對NCBI數據庫結核桿菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此區域應用Primer5.0 和Primer express 3.0軟件設計引物與探針，探針的5’端標以熒光發射基團FAM標記，靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA標記 (表1) 。Forward Primer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGG3’；Reverse Primer：5’GGGTAGCAGACCTCACCTATGTG3’；Probe：5’CACGTAGGCGAACCCTGCCCA3’。

       1.3  儀器

       ABI公司的ABI7500熒光Real－time PCR儀。

       1.4  痰液DNA提取

       1.4.1  痰液樣品的預處理

       吸取待測痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500μl，混勻，室溫中搖動20min。加入1mol/L NaH2PO4 700μl，混勻(起中和作用)，10 000rmp離心5min。去上清液，補加TE至100μl，混勻，加入20μl濃度為50mg/ml的溶菌酶。置37℃消化30min。

       1.4.2  DNA的提取

       細胞復合裂解液置65℃水浴中，使其中的結晶溶解。將300μl結晶已溶解的細胞復合裂解液加入到上述預處理好的痰液樣品中，混璇器震蕩混勻20秒，置65℃水浴中反應20min。加入200μl蛋白沉淀液，上下顛倒5～6次使兩者混勻。16 000rmp離心3min。將上清液(約500μl)轉移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，此時可見透明的絮狀物，混勻后16 000rmp離心3min，傾去上清。加入200μl 70％的乙醇溶液，來回倒置，清洗管壁，16 000rmp離心3min。吸去70％乙醇，倒置離心管于干凈的濾紙上，乙醇揮發完全，加入30μl DNA溶解液，快速漩渦震蕩1～2秒，使沉淀的DNA完全溶解。