聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白

發布時間：2019-12-16 13:38 原文鏈接：聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白

掌握一種聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質的方法，并用此法進一步分析血清蛋白的組成。

1、聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）、NN′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis），在催化劑過硫酸銨[ammonium persulfate （NH4）2S2O8 簡稱AP）或核黃素（ribofavin 即vitaminB2，C17H20O6N4）和加速劑N，N， N′，N′-四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-ytetramethyl ethyenediamine，簡稱TEMEM）的作用下，聚合而成的三維網狀結構。

a.目前常用的催化體系：

(1) Ap—TEMED：

① TEMED催化Ap生成硫酸自由基：

S2O82-→2SO4-
　　（過硫酸）　（硫酸自由基）

②硫酸自由基的氧原子激活Acr單體，并形成單體長鏈：

③Bis將單體長鏈間連成網狀結構：

從反應式中可看出此凝膠是三維網狀的，帶不活潑的酰胺基側鏈的聚合物，沒有或很少帶有離子側鏈，因而凝膠性能穩定，無電滲作用。在堿性條件下，凝膠易聚合，其聚合的速度與Ap濃度平方根成正比。雜質、某些金屬離子，低溫和氧分子能延長或阻止碳鏈的延長與聚合作用。用此法聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠。

(1) 核黃素-TEMED：

這是光聚合作用。TEMED可加速凝膠的聚合，但不加也可聚合，光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能發生，核黃素在TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發聚合作用。但過量氧會阻止鏈長的增加，因此應避免過量氧的存在。

b.凝膠的性質

(1) 機械性能與孔徑

T＝（a+b）/m×100% T：凝膠總濃度，a：Acr克數，b：Bis克數，m：緩沖液體積（ml）。

C=b/(a+b)×100% C：交聯度

a/b（w/w）與凝膠的機械性密切相關。當a/b<10時凝膠脆而易碎，堅硬呈乳白色；a/b>100時，即使5%的凝膠也呈糊狀，易斷裂。預制備完全透明而又有彈性的凝膠應控制a/b=30左右。不同濃度的單體對凝膠性能影響很大，B.J.Davis的實驗發現Acr<2%，Bis<0.5%，凝膠就不能聚合，當增加Acr濃度時要適當降低Bis的濃度，通常T為2%～5%時，a/b=20左右；T為5%～10%時，a/b=40左右。T為15%～20%時，a/b＝125～200左右。在研究核酸大分子時，常用T=2.4%大孔凝膠，此時凝膠太軟不易操作，最好加入0.5%瓊脂糖，有的在3%凝膠中加入20%蔗糖，也可增加其機械強度而不影響其孔徑的大小。一般來說，T濃度大，孔徑小，移動顆粒穿過網孔阻力大；T濃度小，孔徑大，移動顆粒穿過網孔阻力小。

（2）分子量范圍與凝膠濃度關系如下表1-2-9

2、電泳原理

（1）濃縮效應

①凝膠孔徑不連續；樣品膠T=2.5%為大孔膠，分離膠T=7.5%為小孔膠。在電場的作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動速度快，當進入小孔膠時，蛋白質顆粒泳動受到的阻力大，移動速度減慢，所以在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續性，使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。

表1-2-9 分子量范圍與凝膠濃度的關系

②緩沖體系離子成分及pH值的不連續性（電位梯度不連續性）樣品膠和濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl，緩沖液，電極緩沖液為pH8.3的Tris-Gly。HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl^-，而Gly的pI為5.97，所以Gly在樣品膠和濃縮膠中解離度很小，僅有1%～0.1%。而有效遷移率＝mα（m為遷移率，α為解離度），所以Cl^-的有效遷移率最快成為快離子，而Gly的有效遷移率最慢成為慢離子，在樣品膠和濃縮膠中所選用的pH值必須使有效遷移率滿足下述條件：

快離子>樣品離子>慢離子。因此在快離子后邊形成一個離子濃度低的區域，即：低電導區，又因為E＝I/η（E：電位梯度，η：電導率，I：電流）。低電導率將產生一個高電位梯度，因而在高電壓梯度區和低電壓梯度區之間，形成一個迅速移動的界面（如圖1-2-11）。由于樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，所以就聚集在這個移動的界面附近，被濃縮成一狹小的樣品薄膜。

圖1-2-11不連續電泳濃縮效應示意圖