化學鍵合相色譜儀C18色譜柱填料的粒徑、孔徑、孔體積、鍵合反應、含碳量和端基封尾等對色譜行為有重要影響。
一、粒徑：
粒徑是指柱填料的顆粒直徑大小。實際上色譜柱上所標的粒徑是顆粒粒徑的平均值。
一般來說，平均粒徑越小，顆粒分布度越小，柱效越高。反之越低。
目前C18柱填料粒徑在4～10um之間。
二、孔徑：
孔徑是指柱填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是填料的平均孔徑。
無定形填料的平均孔徑分布較寬，柱床結構不均勻，流動相速度不均勻，譜帶展寬。
球形填料的平均孔徑分布比較窄，柱床結構均勻，柱效高，重現性好。
平均孔徑的大小對大分子化合物的分離影響較大。在用反相色譜分離如蛋白和多肽樣品時，應選用大孔徑（如30nm）的反相柱填料。
三、孔體積：
在分離較大分子化合物時，應選用較大孔體積的反相柱填料。
四、鍵合反應：
C18柱是以硅烷化鍵合型（Si－O－Si－C）存在的，這類鍵合反應目前應用zui為普遍。
可以鍵合極性較大的有機基團，采用極性較小的溶劑作流動相。
可以鍵合極性較小的有機基團，采用極性較大的溶劑作流動相。
五、含碳量：
碳含量是指填料中的含碳量。
傳統的測量技術是將填料加熱到碳氫鍵斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計算含碳量。
鍵合相的色譜行為與鍵合密度、填料的密度和填料的表面積有關。通過增加鍵合密度或碳鍵長度，可增加含碳量，增加柱子的保留值。填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用兩種不同密度和相同含碳量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨以含碳量來預測色譜行為是不夠的。
六、端基封尾：
端基封尾是用氯化三甲基硅烷等試劑與鍵合相表面的殘留硅醇基反應，將殘留硅醇基封鎖起來的化學處理過程。
1、原因：
殘余的硅醇基會對鍵合相的分離性能產生影響，特別是在非極性鍵合相的情況下，硅醇基的存在會降低硅膠表面的疏水性。對極性化合物或溶劑產生吸附，使鍵合相的分離性能改變。
2、方法：
為了進一步消除殘留的游離硅醇基，一般在鍵合反應后再用封尾劑鈍化，也可用十八烷基三氯硅烷再鍵合一次。
最常用的封尾劑有三甲基氯硅烷和六甲基乙硅氧烷。
3、作用：
（1）經封尾處理的硅膠基質固定相減小了溶質與固定相之間的次級相互作用，使分離效果明顯改善。
（2）可改善對極性化合物的吸附或拖尾。