Cell：揭示SARSCoV2刺突糖蛋白的結構、功能和抗原性

　　自21世紀初以來，三種冠狀病毒已越過物種壁壘，導致人類致命的肺炎：嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征（MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2（之前稱為2019年新型冠狀病毒, 2019-nCoV）。

　　SARS-CoV于2002年在中國廣東省出現，并通過航空旅行路線傳播到五大洲，感染8098人，造成774人死亡。2012年，MERS-CoV出現在阿拉伯半島，并傳播到27個國家，共感染約2494人，并奪走了858人的生命。如今，它仍然是阿拉伯半島的一個主要的公共衛生問題。2019年12月在中國湖北省武漢市發現了一種以前未知的冠狀病毒SARS-CoV-2，并于2020年1月對它進行了分離和測序。SARS-CoV-2與正在進行的非典型肺炎（Covid-2019）有關，截至2020年2月15日，它已影響29個國家的80000多人，并殺死了2700多人。2020年1月30日，世界衛生組織（WHO）宣布SARS-CoV-2疫情是國際關注的突發公共衛生事件。

　　MERS-CoV被認為起源于蝙蝠，但促進它溢出到人類的中間宿主是單峰駱駝。SARS-CoV和SARS-CoV-2彼此密切相關，都起源于蝙蝠，因此蝙蝠最有可能是這兩種病毒的天然宿主。盡管果子貍已被公認是在蝙蝠和人類之間傳播人畜共患病病原體SARS-CoV的中間宿主，但是SARS-CoV-2的中間宿主仍然未知。

　　冠狀病毒在人類中多次溢出以及在蝙蝠中檢測到許多冠狀病毒，包括許多SARS相關冠狀病毒（SARS-related coronavirus, SARSr-CoV），這提示著未來的人畜共患病傳播事件可能會繼續發生。除高致病性的屬于β-冠狀病毒屬的人畜共患病病原體SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2之外，四種低致病性冠狀病毒是人類特有的：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E。迄今為止，尚未批準針對任何感染人類的冠狀病毒的藥物或疫苗。

　　冠狀病毒進入宿主細胞是由跨膜刺突（S）糖蛋白（下稱S蛋白）介導的，其中S蛋白形成從病毒表面突出的同型三聚體。S蛋白包含兩個功能性亞基S1和S2，其中S1負責與宿主細胞受體結合，S2亞基負責病毒膜和細胞膜融合。對于許多冠狀病毒而言，S蛋白在S1和S2亞基之間的邊界處受到切割，而S1和S2亞基在融合前的構象中保持非共價結合。位于遠端的S1亞基包含受體結合結構域，并有助于穩定包含融合裝置（fusion machinery）的膜錨定S2亞基的融合前狀態。對于所有的冠狀病毒而言，S蛋白會在緊鄰融合肽上游的所謂S2'位點被宿主蛋白酶進一步切割。有人已經提出這種進一步切割通過廣泛的不可逆的構象變化激活S蛋白以進行膜融合。由此可知，冠狀病毒進入易感細胞是一種復雜的過程，需要S蛋白的受體結合和蛋白水解過程協同作用以促進病毒-細胞融合。

　　不同的冠狀病毒使用S1亞基內的不同結構域來識別各種附著受體和進入受體，這取決于冠狀病毒種類。地方性人類冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1通過S蛋白的結構域A（下稱結構域A）附著到位于宿主細胞表面的糖蛋白和糖脂上的5-N-乙酰基-9-O-乙酰基唾液酸苷，從而使得它們能夠進入易感細胞。然而，MERS-CoV的S蛋白使用結構域A來識別非乙酰化唾液苷附著受體，這可能會促進S蛋白的結構域B（下稱結構域B）隨后與一種稱為二肽基結合肽酶4的進入受體結合。SARS-CoV和幾種SARSr-CoV通過結構域B與血管緊張素轉化酶2（ACE2）直接相互作用而進入靶細胞。

　　由于冠狀病毒S蛋白暴露于病毒表面并介導病毒進入宿主細胞，因此它是感染后中和抗體的主要靶標，也是藥物開發和疫苗設計的重點。S蛋白三聚體受到N-連接聚糖的廣泛修飾，這對于它們的正確折疊和調節宿主蛋白酶和中和抗體的可接觸性至關重要。美國華盛頓大學醫學院生物化學系的David Veesler博士及其團隊之前描述了從SARS-CoV或MERS-CoV感染者的罕見記憶B細胞中分離出強效的與SARS-CoV或MERS-CoV的S蛋白結合在一起的人類中和抗體，這就為競爭性抑制結構域B附著到宿主受體上的機制提供了分子水平上的信息（Cell, 2019, doi:10.1016/j.cell.2018.12.028）。作為這種針對SARS-CoV S蛋白的人類中和抗體，抗SARS-CoV抗體S230還可在功能上模擬受體附著和通過一種揭示這種冠狀病毒膜融合激活獨特性質的分子棘輪機制（molecular ratcheting mechanism）促進病毒刺突融合構象重排。

圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.02.058。

　　在一項新的研究中，Veesler團隊報道人ACE2可調節SARS-CoV-2 S蛋白介導的細胞進入，從而確定它是這種新出現的冠狀病毒的功能性受體。SARS-CoV-2 S蛋白的結構域B與人ACE2結合的親和力與來自與2002-2003年SARS疫情相關的SARS-CoV分離株的S蛋白的結構域B相當，這表明SARS-CoV-2 S蛋白的結構域B與人ACE2具有較高的結合親和力。與人ACE2的緊密結合可以部分解釋SARS-CoV-2在人類中的有效傳播，就像SARS-CoV的情況一樣。相關研究結果以論文手稿的形式在線發表在Cell期刊上，論文標題為“Structure, function and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein”。

　　他們鑒定出在SARS-CoV-2 S蛋白的S1/S2亞基邊界存在意料之外的弗林蛋白酶（furin）切割位點，這個位點在S蛋白的生物合成過程中被切割，這種新特征可將這種冠狀病毒與SARS-CoV和SARSr-CoV區分開來。正如針對一些高致病性禽流感病毒和致病性新城疫病毒的報道那樣，移除這種切割基序會適度影響SARS-CoV-2 S蛋白介導的VeroE6或BHK細胞進入，但是這可能有助于擴大這種冠狀病毒的宿主趨向性。

　　他們解析出SARS-CoV-2 S蛋白胞外結構域三聚體的低溫電鏡結構，并揭示它具有多個結構域B構象，這使人想起了先前有關SARS-CoV S蛋白和MERS-CoV S蛋白的報道。他們證實SARS-CoV S蛋白小鼠多克隆血清有效抑制SARS-CoV-2 S假病毒進入靶細胞。這些結果為設計可廣泛預防SARS-CoV-2、SARS-CoV和SARS-CoV的疫苗鋪平了道路。

　　受體識別是病毒感染的第一步，也是宿主細胞和組織趨向性的關鍵決定因素。有人已提出SARS-CoV S蛋白與人ACE2之間的結合親和力增強與人類中的病毒傳播性和疾病嚴重性增加相關。確實，來自2002-2003年SARS疫情的三個階段的SARS-CoV分離株在人與人之間的傳播效率和致病性方面要比與2003-2004年僅導致少量病例的SARS疫情再出現相關的分離株更高，這與它們與人ACE2的結合親和力相一致。而且，與不同動物物種的ACE2結合的能力似乎反映了宿主對SARS-CoV感染的易感性，并促進了這種病毒從動物向人類的跳躍。在這項新的研究中，這些研究人員報道SARS-CoV-2使用人ACE2作為進入受體，它結合人ACE2的親和力與2002-2003 SARS-CoV分離株相似，這提示著它能夠在人類中有效傳播，這與迄今為止報道的大量SARS-CoV-2人際傳播事件相一致。

　　除了S蛋白與宿主細胞受體結合外，宿主蛋白酶通過在S蛋白的S1/S2和S2'位點進行切割以激活S蛋白是調節宿主趨向性和致病性的另一個關鍵因素。比如，與MERS-CoV相關的蝙蝠冠狀病毒HKU4進入人細胞需要加入外源胰蛋白酶，這表明這種蝙蝠冠狀病毒的S蛋白的蛋白水解激活并沒有在人細胞中發生。隨后的研究提示著在S1/S2邊界附近存在的聚糖是HKU4 S蛋白缺乏蛋白水解激活作用的原因，并且移除這種聚糖可增強HKU4 S假病毒進入人細胞的能力。

　　可通過弗林蛋白酶樣蛋白酶加工的多元切割位點（polybasic cleavage site）的存在是幾種高致病性禽流感病毒和致病性新城疫病毒的典型特征。令人關注的是，SARS-CoV-2 S蛋白在S1/S2邊界具有弗林蛋白酶切割位點，這個切割位點在生物合成過程中被加工。弗林蛋白酶切割位點的存在使SARS-CoV-2 S蛋白與SARS-CoV S蛋白和SARSr-CoV S蛋白區分開，這是因為后二者在S1/S2邊界具有一元切割位點（monobasic cleavage site），這個切割位點在進入靶細胞時被加工。Veesler團隊推測，相對于SARS-CoV，弗林蛋白酶樣蛋白酶幾乎無處不在的表達可能參與擴大SARS-CoV-2的宿主細胞和組織趨向性，以及增加它的傳播性和/或改變它的致病性。

　　Veesler團隊以前已提出冠狀病毒使用構象掩蔽（conformational masking）和聚糖屏蔽（glycan shielding）來限制被感染宿主的免疫反應識別。如今，他們發現與SARS-CoV S蛋白和MERS-CoV S蛋白相類似的是，SARS-CoV-2 S蛋白三聚體以三種不同的構象狀態存在，這是由S蛋白的結構域B在這種三聚體頂點處打開引起的。這些結構變化對于這三種病毒的受體結合是必需的，并導致融合構象變化的啟動。

　　相比之下，對于其他四種感染人類的冠狀病毒：HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-229E，僅檢測到了封閉的S蛋白三聚體。鑒于已知HCoV-NL63和HCoV-229E通過結構域B結合蛋白受體，因此它們的S蛋白三聚體也有望打開，以暴露它們的被掩埋在封閉的S蛋白三聚體中的不同原聚體（protomer）之間界面上的受體結合基序。不論宿主受體的性質如何，也不論受體結合結構域的位置如何，移除三聚體S1冠狀結構對于所有冠狀病毒來說都是必要的，以允許大規模S2構象變化，從而導致病毒膜和宿主膜融合。總體而言，這些數據強調在高致病性人冠狀病毒中發現的S蛋白三聚體似乎以部分打開的狀態存在，而在與普通感冒相關的人冠狀病毒中它們大體上保持封閉狀態。基于上述將SARS-CoV與人ACE2的結合親和力與不同物種中的傳播率、病毒復制和疾病嚴重程度相關聯在一起的數據，Veesler團隊猜測最具致病性的冠狀病毒會表現出S蛋白三聚體自發地采取封閉和開放的構象，就像SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV中的那樣。

　　SARS-CoV-2 S蛋白和SARS-CoV S蛋白之間驚人的結構相似性和序列保守性突顯了這兩種通過識別人ACE2進入靶細胞的冠狀病毒之間的密切關系。在這項新的研究中，Veesler團隊發現SARS-CoV-2 S蛋白引發的多克隆抗體反應強效地中和SARS-CoV-2 S蛋白介導的細胞進入，從而進一步增強了這種相似性。

　　他們推測這些抗體中的大多數都靶向高度保守的S2亞基（包括融合肽區域），理由在于：SARS-CoV-2和SARS-CoV S2亞基的結構類似性；幾種針對結構域B的抗體缺乏交叉反應性；之前的研究已發現來自SARS-CoV感染者的血清靶向這個區域。他們注意到，迄今為止分離出的大多數SARS-CoV中和抗體都靶向結構域B，其中的一些中和抗體識別受體結合基序并阻止受體結合。鑒于SARS-CoV-2和SARS-CoV結構域具有75％的氨基酸序列一致性（sequence identity），因此在未來有必要進一步評估這些抗體是否能夠中和這種新出現的冠狀病毒。

　　這些發現還表明，在使用S蛋白胞外結構域三聚體的血清學研究中，可能很難將SARS-CoV-2的暴露與其他SARSr-CoV的暴露區分開，因此將需要設計特定的檢測方法。這些結果提供了一個結構框架以識別S蛋白中保守性的和可訪問的表位，這將支持正在進行的疫苗設計工作。最后，在動物宿主中循環的病毒的多樣性和防止病毒中和逃逸突變的可能出現來看，多克隆抗體反應的誘導可能是關鍵。