非抑制離子色譜法測定左旋肉堿

【非抑制離子色譜法測定左旋肉堿】

左旋肉堿(L-carnitine, β-羥基γ-三甲銨丁酸)又稱肉毒堿或維生素BT，其化學式為C₇H₁₅O₃N，分子量為162.2，是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸。L-肉堿的主要功能是參與動物體內的脂肪代謝，它作為載體將長鏈脂肪酸從腺粒體膜外輸送到膜內，促進脂肪酸的β-氧化，從而促進脂肪的代謝，因此左旋肉堿具有多種重要的生理功能。

左旋肉堿已廣泛應用于醫藥、保健和食品等領域，被瑞士、法國、美國和世界衛生組織規定為法定的多用途營養劑。我國食品添加劑衛生標準GB2760-1996規定了左旋肉堿酒石酸鹽為食品營養強化劑，可應用于咀嚼片、飲液、膠囊、乳粉及乳飲料等。市場上已出現了許多以左旋肉堿為主要功能的減肥產品。

左旋肉堿極性較強，缺少發色基團，定量分析困難。國內外對左旋肉堿的測定主要有酶法、電泳法、電化學法，高效液相色譜法等。高效液相色譜法中有的需要衍生、有的靈敏度較低。其它方法準確性較差，設備較貴等原因較少使用。

離子色譜法可測定在水溶液中能電離的物質。在酸性溶液中，左旋肉堿表現為陽離子特性，帶正電荷，可用陽離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的兩性特征使其無法采用抑制型電導檢測。為此，我們通過實驗，摸索出左旋肉堿的非抑制型離子色譜測定的新方法。該方法前處理簡便、檢測快速，用于實際樣品的檢測，結果令人滿意。

實驗條件

儀器條件

儀器：ICS系列離子色譜系統帶柱溫箱;分析柱：IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm;流動相組成：MSA：0~22 min，5 mM;流速：1 ml/min;柱溫：30℃;檢測方式：抑制型電導檢測;進樣量:25 μl。

樣品前處理

膠囊：拆開膠囊外皮，稱取其中的粉末樣品約0.1g，至100 ml容量瓶中，用超純水定容到100 ml后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液，4000 r/min離心20 min后，將溶液通過0.22μm尼龍濾膜和On Guard II RP柱，棄去6 ml初始流出液后采集2 ml樣品用于離子色譜測定。

咀嚼片：將咀嚼片粉碎，混勻，稱取其中的粉末樣品約0.1 g至100ml容量瓶中，用超純水定容到100 ml后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液，4000 r/min離心20 min后，將溶液通過0.22μm尼龍濾膜和On Guard II RP柱，棄去6 ml初始流出液后采集2 ml樣品用于離子色譜測定。On Guard II RP柱(2.5 cc)，預先使用10 ml甲醇和15 ml水活化。

結果與討論

前處理條件的選擇

減肥產品中，通常加入左旋肉堿穩定形式的左旋肉堿酒石酸鹽。左旋肉堿酒石酸鹽易溶于水，但不易溶于有機溶劑。離子色譜的淋洗液是水溶液，因此選用水作提取劑。對用水作溶劑提取極性化合物，超聲提取是有效的提取方法。我們考察了用超聲提取時，提取溫度與提取時間對回收率的影響，實驗結果列于表1和表2。

從表1數據可見，增加提取時間，測得結果逐漸增大，當提取時間大于20min后，提取效率增大不明顯了。考慮到某些基體復雜的減肥產品，可將提取時間適當延長，因此提取時間選擇為30 min。表2中，30 ℃時測得左旋肉堿含量已經是50 ℃時的99.9%，這說明30 ℃左旋肉堿的提取已經充分。因此選擇在30℃、30 min下超聲提取即可。

表1. 30℃下，提取時間對回收率的影響

表2. 提取溫度對回收率的影響

色譜柱的選擇

按實驗方法，我們比較了左旋肉堿在IonPac SCS1、IonPac CS12A、IonPac CS17三種不同色譜柱上的出峰及分離情況。SCS1柱為硅膠基質的色譜柱，不耐酸堿，雖然可用低濃度(3 mM)的淋洗液等度洗脫，但L-肉堿在該柱拖尾嚴重，對稱因子為4.05，靈敏度不高。CS12A柱的離子交換功能基團為羧基/磷酸基，柱容量高(2800 ueq)，親水性較CS17柱弱，對一價和二價陽離子的保留相對較強，對疏水性比較強的L-左旋肉堿離子保留比較強，需用高濃度的淋洗液才能洗脫保留的陽離子，這會導致高的背景電導和高的檢出限。采用15.56 mM的甲基磺酸在CS12A柱上等度淋洗左旋肉堿，背景電導5371 uS，色譜峰的對稱因子2.25，理論塔板數1936，可見對稱性和柱效也不好。CS17柱功能基團為羧酸基，柱容量(1450 ueq)較CS12A柱低，可用較低濃度的淋洗液洗脫一價和二價陽離子，因此降低背景電導，提高檢出限。L-肉堿在此色譜上對稱性良好，5 mM等度淋洗，對稱因子為1.17，與可能存在的其它陽離子易于分開。因此，選擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿的色譜柱。

淋洗液濃度的確定

我們選用不同濃度的甲基磺酸，測定混合標樣a中左旋肉堿的色譜分析特征。隨著淋洗液濃度降低，背景電導降低，噪聲降低，理論塔板數提高，各成分間的分離度增大，對稱因子降低，峰形改善(如表3所示)。但由于濃度降低，酸度降低，導致峰高降低，靈敏度降低。因為L-肉堿是弱堿，溶液的酸度減弱，L-肉堿的解離減弱，電導響應也將減弱。同時，更低濃度的酸使各成分的保留時間明顯增長，特別是兩價離子的保留時間增加更多，當濃度

降低到3 mmol/L時，Ca²⁺的保留時間大于50 min，不利于提高分析效率(如表4所示)。綜合考慮，我們選擇5 mmol/L的甲基磺酸作為分析用淋洗液。

表3. 不同淋洗液濃度對左旋肉堿分析能力的影響

表4. 不同淋洗液濃度對各種離子保留時間的影響

a Li⁺(0.5 mg/L); Na⁺(5 mg/L); NH₄⁺(5 mg/L); K⁺(5 mg/L); L-carnitine(400 mg/L); 6 Choline+Acetylcholine(50 mg/L + 50 mg.L) ; 7 Mg²⁺(5 mg/L); 8 Ca²⁺(5 mg/L)

干擾實驗

由于鉀、鈉、鈣、鎂、銨為水中的常見離子，在樣品中普遍存在。而某些含左旋肉堿的保健產品也會添加膽堿類類物質例如膽堿及乙酰膽堿來促進脂肪運輸和神經發育。因此我們考察了常見陽離子及膽堿和乙酰膽堿對左旋肉堿出峰的影響。從圖1可見，常見六種陽離子能與左旋肉堿較好分離。50 mg/L的膽堿和乙酰膽堿與400 mg/L的左旋肉堿出峰互相不干擾，分離度達到2.72.

圖1. L-肉堿及共存離子分離色譜圖。

檢出限與線性范圍

按實驗方法在選定的色譜條件下，對左旋肉堿進行線性和檢出限測定。檢出限按照S/N=3進行測算，Noise=0.06 μS。數據見表5。在選定的濃度范圍內，線性相關系數r>0.999。左旋肉堿檢出限1 mg/g。

表5. 左旋肉堿檢出限與線性范圍

精密度與回收率

按實驗方法，取減肥產品進行不同濃度加標試驗，連續進樣5次，測定左旋肉堿平均回收率和精密度，結果列于表6，該方法的回收率在87.9%~106%之間，RSD小于6.6%。

表6. 方法的回收率與精密度(n=5)

實際樣品分析

按實驗方法，對市售標示含有左旋肉堿的減肥產品進行了測試，結果見表7及圖2。

表7. 實際樣品中左旋肉堿含量

(-*: Not Detected)

圖2. 實際樣品分離譜圖。

小結

采用非抑制型離子色譜法來測定左旋肉堿具有簡單、快速、干擾少、環保等特點。相比常見液相色譜方法，無需衍生化，避免了繁瑣的操作，節約時間，重復性好。該方法可用于減肥產品中左旋肉堿的含量測定。