圖1.
（A）采用二維凝膠電泳法進行U937細胞中蛋白質提取的對比試驗示意圖。（B）采用Coomassie藍顯色的凝膠：（S）為采用滅菌瓶裝水進行加工；（U）為采用純水加工。（C）凝膠的三維密度掃描圖像分析表明，相對于瓶裝水制備的凝膠（上圖），系統新制純水制備的凝膠中出現的斑點數量更大（下圖）。
通過制備凝膠進行二維凝膠電泳實驗時，將滅菌的瓶裝水與新制備的純水進行了比較，結果顯示，水的質量已經影響到蛋白質的分離效果。另外，應用0.22μm終端濾膜新制備的純水，取得了更好的分離效果。
二維凝膠電泳是蛋白組學研究中最重要和最常用的技術，其分離結果會因樣品制備、電泳、染色和數據處理等方面的問題受到嚴重影響，保證二維凝膠電泳得到準確、具有重現性結果的重要手段之一，就是應用高純水。
瓶裝水與新制純水
實驗室中純水的來源通常是瓶裝水和制水系統。裝置良好的制水系統生產的水，僅含有極微量的離子（電阻為18.2 Ω·cm）和有機化合物（總有機碳TOC＜3ppb）。供水系統通過反滲透技術（RO）、電法去離子化技術（EDI）、離子交換樹脂以及活性炭吸附、紫外線氧化滅菌技術生產純水。通過取水處的終端過濾，例如超濾膜，純水便能符合實驗室的特殊應用。
本文將滅菌的瓶裝水（Baxter）與新制備的純水進行了比較。純水通過Milli-Q系統采用內置超濾器制備，生產純水的電阻為18.2Ω·cm，TOC＜10ppb。自來水經過Elix-System裝置的RO和EDI處理為系統提供進水。
兩種純水的應用比較
為了比較兩種純水用于二維凝膠電泳時的性能，進行了帶大腸桿菌提取物的二維凝膠的制備平行試驗（如圖1A）。一維上應用了3~10的線性pH范圍；二維上的分離則在含12%的SDS(十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯酰胺的凝膠上進行。采用Coomassie藍或銀顯色劑使其顯色，Coomassie藍是凝膠的普通顯色劑，而銀顯色劑的靈敏度超過100倍，但受污染作用的影響也要嚴重100倍。
圖2.
（A）采用二維凝膠電泳法進行E-大腸桿菌中蛋白質提取的對比試驗示意圖。（B）為以Coomassie藍顯色的二維凝膠：（M）采用0.22μm濾膜過濾的純水；（U）采用超濾過濾器純水進行制備。（C）密度掃描圖像分析表明：相對于采用超濾過濾器純水而言，采用0.22μm濾膜過濾的純水能夠得到更好的分離度與更敏銳的斑點。
兩種不同來源的水在一維分離中被用于重氫化溶液和平衡緩沖液和12%的SDS（十二烷基硫酸鈉）-聚丙烯酰胺-凝膠的制備，在二維分離中被用于緩沖溶液和染色溶液的制備。如圖1B所示，采用瓶裝水制備和加工的凝膠顯示出明顯的條痕，可能是不完全或不適當的聚焦、蛋白質重疊、樣品前處理以及蛋白質離析所致。而緩沖液和凝膠配制用水受到污染，也會導致嚴重條痕現象的出現，例如鹽分和有機物的進入，可導致不良的聚焦，并在水平方向上形成條痕。水質的污染同樣也會影響到二維方向上凝膠的不均勻或不完全聚合，從而導致在垂直方向上形成條痕。
采用純水制備和加工的凝膠（如圖1B所示，對于在本圖中未有顯示的銀染色凝膠亦然），卻顯示出微小的條痕，以及明顯的蛋白質斑點。在以純水制備的凝膠上檢測出407個蛋白質斑點，而采用瓶裝水制備的凝膠上則僅發現了206個斑點（見圖1C）。這一結果表明，水的質量已經影響到采用二維法分離蛋白質的效果。
不同終端過濾方式的比較
本研究對兩種不同終端過濾方式進行了比較，分別為超濾過濾器和0.22μm濾膜過濾器。兩者均由Elix-3 UV System提供進水，而由Milli-Q Advantage A10 System提供具有18.2 Ω·cm電阻和TOC ＜ 5 ppb的純水。Milli-Q System裝備兩種終端過濾器，即超濾過濾器（Biopak）和0.22μm濾膜過濾器。超濾過濾器能有效地去除核酸，因而廣泛地應用于生命科學實驗。
圖3. 預濃縮后水的HPLC譜圖，綠線表示超濾過濾器得到的水，藍線表示采用0.22 μm濾膜過濾得到的水。（A）為UV 210nm檢測；（B）為ESI正離子的質譜圖。
0.22μm濾膜過濾器則因能證實含量甚微的可萃取物質，在一定條件下更適用于蛋白組學分析。采用Coomassie藍進行顯色時，對于分子質量大的物質，超濾過濾器處理的純水所制備的凝膠堿性pH介質中會出現條痕（見圖2B右上方），而通過0.22μm濾膜過濾處理的水產生的斑點則更好地分布于凝膠中（見圖2B）。這種相鄰斑點之間更好的分離度以及對斑點的分析，通過密度掃描圖像分析得到了證實（見圖2C）。
采用HPLC-MS對超濾過濾器得到的純水和0.22μm濾膜得到的純水所產生的污染情況進行了比較。將待測水通過C18預柱進行預濃縮60min，此時有機污染物富集于預柱頂部，當進行梯度淋洗時，有機溶劑便將污染物帶出柱外，這些污染物經由質譜檢測器進行檢測。圖3顯示，相對于0.22μm濾膜過濾水，采用超濾過濾器的水在UV和質譜圖中出現了數量更多的雜質峰。由此可以判斷，超濾過濾器可能會造成超濾水受到污染，進而影響凝膠的質量，影響蛋白質分離效果。
小結
實驗數據表明，二維凝膠分離中使用的純水，會影響蛋白質的分離效果。鹽分和有機微粒帶來的污染，可改變緩沖液的離子強度，從而影響蛋白質的遷移。儲藏容器或管道中的污染物，可能對純水質量產生影響，從而導致不良的分離，例如瓶裝水制備凝膠時已經引起了條痕。應用具有0.22μm終端濾膜的制水系統新鮮制備的純水，二維凝膠電泳法，能夠得到良好的蛋白質分離效果。
凝膠電泳實驗的純水質量
在進行二維凝膠電泳法分析時，除了高質量的試劑外，水的質量也非常重要，甚至會對結果產生決定性影響。實際研究表明，應用新鮮制備的純水可以得到分離效果更好的凝膠。此外，推薦采用過濾膜，其對污染雜質的濾除效果遠超過普通超濾過濾器。
