在法醫和毒物學實驗室中,攪拌棒吸附萃取法(SBSE)可用來對血液、尿液和組織樣品進行萃取,然后使用熱解吸技術進行解吸,從而更好地轉入GC-MS對其中的毒品和藥物殘留物進行分析檢測。減少了樣品前處理的過程,并避免了溶劑的大量使用。
為了查明死亡原因、毒品或濫用藥物以及其他事實,法醫毒物學需要對人體體液和人體組織中的藥物活性成分、毒品及其降解產物進行確證,最為常用的方法當屬GC/MS。但在GC/MS之前,需要將這些活性物質或代謝物從其生物基體中離析出來。對于這類樣本最常用的前處理方法都是基于液液萃取、固相萃取或蛋白質沉淀法,這些方法的缺點在于:費工、費時,有些還要使用有毒的有機溶劑。現在已成功開發了一種帶有Gerstel-磁子的攪拌棒吸附萃取法,可以將有機化合物從其水相基體中萃取出來,而且幾乎無需樣品前處理。
這種磁子是一種特殊的以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為外層覆膜的磁性攪拌轉子,當磁子攪動樣品溶液時,溶質便被萃取到磁子的表層中,萃取完成后將磁子從樣品溶液中取出,用蒸餾水洗去基體殘留液,擦干,置于提前準備的解吸附單元中(熱解吸單元
TDU)進行解吸,然后轉入GC-MS中定量分析。攪拌棒吸附萃取法易于操作,無需復雜的樣品前處理步驟,而且可實現部分自動化。按照磁子形狀不同其吸附體積介于20~130
μl之間。與之相比,SMPE(固相微萃取纖維)纖維的吸附體積則僅為0.5μl。
應用攪拌棒吸附萃取法時,除了顯示出良好的重現性,還顯示出很低的檢測限(亞ng/L級),其優勢在疏水性有機物方面更加明顯,萃取物能定量地轉入到GC 柱上。
圖2. 具有攪拌棒吸附萃取裝置、多用進樣器(MPS)、Gerstel熱解吸單元的GC/MS系統。
優化SBSE的回收率
對一種待檢測的溶質應用SBSE法得到的回收率,可以用KO/W值進行計算。KO/W是一個無量綱數值,該值是指在一定溫度下某種化學物質在正辛醇和水組成的兩相間的平衡濃度比值。KO/W值大于1意味著該物質在脂中有很好的溶解度,相反,KO/W值小于1則表明該物質在水中的溶解度特別好。這對于SBSE方法的意義在于:凡具有較高logKO/W值(logKO/W>4)的疏水性物質均能以較高的回收率直接萃取。對于具有較低logKO/W值(logKO/W<4)的親水性物質,加入NaCl (20%~ 30%)可以改善回收率。當然在加入鹽的同時也會導致疏水性溶質回收率的顯著降低。因此可以將同一樣品均分為兩等份來應用攪拌棒吸附萃取法,采用不同的萃取條件,可以對化學性質差別很大的化合物進行廣譜性確證。從水相中對疏水性溶質進行萃取時也可以通過加入甲醇來優化。
牛腦組織的SBSE萃取
對攪拌棒吸附萃取法的早期評估中,發現了存在于尿液、水、唾液、牛血清中的特殊毒品和藥物制劑,同樣還發現了酒中的農藥殘留物、地表水中的污染物以及食品中的異物和防腐劑。以下以牛腦組織為例,使用帶Gerstel-磁子的攪拌棒吸附萃取法,從牛腦中萃取出化學屬性不同的生物活性物質。
首先,將2g牛腦組織樣品使用德國IKA試管分散機勻質化,稱量后與液體標準品混合。用eppendorf 公司的5 ml移液管分取大約1g組織溶液。繼而加入經由NaCl 飽和了的5 ml 0.1 M Trisma-緩沖溶液(pH 8.5),放入磁性攪拌子(2 mm長,1 mm PDMS覆膜厚度)。于電磁攪拌臺上以每分鐘1000轉的轉速萃取3h。然后取出磁子,以蒸餾水洗凈,擦干后轉入到熱解吸管中。繼而通過GC/MS予以測定。
圖3. 針對摻有毒品和藥物組分的牛腦樣品進行SBSE-GC/MS的分析結果。
在上述生物活性物質的萃取和分析中應用的儀器包括:Gerstel-熱解吸單元(TDU);Gerstel-冷加樣系統(KAS)帶 LN2選配件;Gerstel多功能進樣器(MPS);安捷倫 6890氣相色譜儀;安捷倫5975質譜檢測儀。
分析結果的解析
當通過對一個樣品的分析得到其中毒物和藥物殘留的含量之后(陽性對照),所用方法可進而用于另一個含有未知藥物和毒品樣品的測定(回跳試驗)。
對于陽性對照色譜圖的求值,是依據安捷倫質譜化學工作站的目標數據庫來進行的。而對于回跳試驗而言,則必須按照“未知的”分析物于色譜圖中查找,這種查找是采用安捷倫化學工作站的解卷積報告軟件(DRS)進行的,包括利用AMDIS(自動化質譜解卷和鑒定軟件)對譜圖進行解卷,以及對解卷后的譜圖在NIST(國家標準和技術研究所)圖書館進行查閱。
除了質譜圖之外,還可應用色譜峰的保留時間作為鑒定的判據,每種組分的保留時間,均于分析之前就已經借助于安捷倫的保留時間鎖定軟件(RTL)與貯存于數據庫中的保留時間進行了對照。每條經由自動化質譜解卷和鑒定軟件數據庫所識別的解卷譜圖,將在NIST圖書館中進一步搜索。此外,這些組成還將借助于化學工作站目標數據庫(與自動化質譜解卷和鑒定軟件數據庫相同的組成)從色譜圖中進行搜索。
由不同的圖書館搜索所得到的結果將自動地匯集于一份報告之中,通過嚴苛的考證得到最終的報告。對于那些需要將結果衍生之后才能進行鑒定的物質,熱解吸單元(TDU)可提供特殊的在線衍生裝置。
分析條件
熱解吸單元(TDU)
溫度:50℃,300℃/min,
280℃(10 min);
氣動:無分流。
冷加樣系統
溫度:-100℃, 2℃/s,
300℃(26 min);
氣動:溶劑排放 50 ml/min,
3min分流;
內襯:石英棉。
氣相色譜儀 GC
爐溫:100℃(1 min),
10℃/min,325℃(6.5 min);
氣動:111.4 kPa,恒壓;
色譜柱:Rxi - 5ms(Restek)30 m×0.25 mm×0.25μm,安捷倫保留時間鎖定軟件RTL,鎖定物質普羅地芬SK F525-A(β-二乙胺基乙醇二苯基丙基乙酸酯鹽酸鹽)。
MSD
MSD:EI 模式,掃描40~570 amu。