SSH是一項可以快速獲取兩個不同生物材料中差異表達基因的分子生物學技術,是快速篩選差異表達基因的有效方法,也是尋找新基因的重要手段。該技術尤其適合以genome尚不完全清晰的物種或者以特殊材料為研究對象的科研工作者。是基因芯片技術的有效補充。
基本流程:通過差減文庫構建,文庫驗證和篩選(逆向斑點雜交),獲得陽性克隆,對陽性克隆測序及生物信息分析,可判定差異基因的情況。另外結合RACE技術可進一步克隆所獲得的差異基因的cDNA全長序列,并可用Northern blot 或Real-Time PCR加以驗證。
抑制性消減雜交文庫技術
是一種革命性的差異表達基因篩選技術。該方法結合了抑制性PCR和消減雜交技術,即御用PCR反應鏈內退火有限于鏈間退火的特點和分子雜交二級動力學原理,經過體系不斷優化建立起來的快捷、有效的差異基因篩選方法。
與傳統的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技術相比,具有低豐度mRNA富集效率高、假陽性低、靈敏度高重復性好等特點。現已廣泛應用于動植物發育和分化、疾病易感性差異、抗藥性差異和組織(病理和正常樣本)差異及微生物基因分型差異的研究。
技術方法成熟有效
不需要利用傳統的物理方法對單鏈、雙鏈cDNA進行分離。只要目的序列存在,就能進行指數擴增,篩選出差異基因片段。
放大稀有轉錄本
本技術在同一操作下完成轉錄本豐度平衡和差減,在我們的模型實驗中,稀有轉錄本至少被放大了5000倍,也就是說,利用本及時可以極大地增加獲得表達差異地稀有轉錄本地可能性。
僅僅需要500ng的poly A+ RNA
與其他的消減雜交方法不同,應用抑制性消減雜交技術只需要0.5-2的poly A+ RNA即可進行有效實驗。如果您只有極少量(50ng-100ng)的總RNA,我們可以通過poly A+ RNA的高保真線性放大技術來合成足量的cDNA來進行抑制性消減雜交實驗。