【摘要】 目的 應用變性高效液相色譜技術(DHPLC)慘煸此鏈分析對鼻咽癌患者XRCC4基因突變進行篩查與鑒定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突變情況，探討 DHPLC在篩查相關基因突變、預測放療敏感性方面的應用。 方法 采用聚合酶鏈反應(PCR)和DHPLC篩查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突變。 結果 對DHPLC圖形異常的PCR擴增片斷進行DNA測序鑒定突變位點及性質，檢測出28例XRCC4基因8號外顯子第377位C變成T，導致126號密碼子的ser→phe，導致氨基酸殘基的替代變化(絲氨酸→苯丙氨酸)。 結論 用PCR睤HPLC篩查結合測序分析檢測XRCC4突變是一種高效、經濟、簡便、可靠的方法。
【關鍵詞】 鼻咽腫瘤 輻射耐受性 突變 腫瘤細胞 培養的 DNA修復 色譜法 高壓液相 基因型
DNA分子是惡性腫瘤放療輻射作用的靶點，細胞對電離輻射反應的分子基礎是DNA損傷[1]。DNA雙鏈斷裂是放射治療過程中的主要損傷形式，而細胞內產生的DSBs可以通過同源重組和非同源末端連接兩種途徑進行修復。未修復的DSBs損傷將導致細胞死亡。近年來的研究表明，DNA修復基因突變、單核苷酸多態性均可改變DNA的修復能力。因此檢測DNA修復基因的分子狀態可能成為個體腫瘤放療敏感性的預測指標。XRCC4 是DNA損傷修復的主要基因之一，缺乏XRCC4的細胞特別容易受到離子輻射的傷害。XRCC4基因的突變可能影響腫瘤細胞的DNA損傷修復能力，進而影響其對輻射的敏感性以及放射治療的療效。因此，XRCC4基因的突變檢測可為其與腫瘤放射敏感性關系的研究以及探討作為腫瘤個體放療敏感性的預測指標的可行性提供研究基礎。
變性高效液相色譜(denaturing high瞤erformance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量篩選基因組DNA序列變異的新手段。本研究采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)和DHPLC慘煸此鏈分析與DNA測序等方法對88例鼻咽癌患者進行XRCC4基因突變篩查與鑒定，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件，為DHPLC技術在篩查相關基因突變，預測放療敏感性的應用方面提供研究基礎。
1 對象和方法
1.1 對象 收集2002年9月-2003年9月福建省腫瘤醫院放療科經病理確診、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年齡(48±12.71)歲(21～76歲);女性21例，年齡(48±11.15)歲 (26～69歲)。治療前經鼻咽鏡取鼻咽活檢組織。DNA抽提試劑盒(德國Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因擴增儀(PTC200，美國BIO睷AD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美國Transgenomic公司)。
1.2 方法
1.2.1 基因組DNA抽提 用組織DNA抽提試劑盒抽提患者鼻咽部癌組織基因組DNA，核酸蛋白檢測儀定量，-20 ℃保存備用。
1.2.2 PCR引物設計與合成 人類XRCC4基因有8個外顯子，因為此基因突變多發生于其1號、4號、7號和8號外顯子，其中第8外顯子較長，需分成2個相互重疊的片段進行擴增，故選擇這4個外顯子設計5對引物。引物由上海博鴻生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列Exon1R
FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG
GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R
FGTGTATGCTTAAAACCAGGC
AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R
FTCAATGCTAAAACAGCAAGT
GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R
FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT
ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R
FGTGAATTGAAACCATTGTGC
GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT
1.2.3 PCR反應體系及條件 PCR反應體系50 μL，含0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反應條件：94 ℃變性10 min→94 ℃ 40 s→54 ℃～64 ℃ 45 s→ 72 ℃ 35 s，循環35次，72 ℃延伸10 min，PCR產物用1%瓊脂糖(含溴化乙錠0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測。
1.2.4 DHPLC篩選XRCC4突變 對有效擴增的PCR 產物行DHPLC篩查突變，檢測PCR反應產物，其分離柱固相為烷基化C18，中間橋分子為TEAA，洗脫緩沖液主要成分為乙腈。標本上機之前通過軟件分析序列的理論溫度分離曲線，摸索出最佳的分離溫度后進行突變篩選分析。
1.2.5 DNA測序 根據DHPLC系統檢測結果，將不同峰型的PCR產物送日本TAKARA公司進行DNA序列測定。
2 結 果
2.1 DHPLC篩查結果 每份樣本均檢測上述5個片段的PCR產物，每份樣品在50 ℃的非變性溫度下均為對稱性單峰;在部分變性的溫度下，1號、4號、7號和8號外顯子的81片斷均為單個色譜峰，只有8號外顯子的82片斷的擴增產物出現雜合峰與純合峰兩種情況，單個色譜峰顯示為純合鏈，雙峰或三峰表示是雜合異源雙鏈。出現雜合峰顯示有突變的異源雙鏈存在。不同樣品的PCR產物的8號外顯子82段在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同(代表峰形見圖1)，提示8號外顯子的82段具有單一類型的突變。
2.2 DNA測序結果 選擇DHPLC檢測為雜合峰與單個峰的標本測序，測序結果顯示28例患者的XRCC4基因第8號外顯子第377位堿基C變成T(圖2)。
3 討 論
DHPLC異源雙鏈分析法是近年來才發展起來的一項新的基因突變高通量篩查技術。與其他相關技術相比，DHPLC的DNA分離柱具有很好的溫度穩定性和酸堿穩定性，具有很長的有效壽命(>6 000次進樣)和極好的分析穩定性(99%)。DHPLC異源雙鏈分析法解決了RFLP技術受酶切位點和酶切條件的限制、擴大了檢測范圍、提高了檢測的準確性、又解決了SSCP技術耗時耗力的缺點，實現了樣品的自動化檢測;同時檢測的靈敏度、重復性和檢測的通量也得到大提高，從而在基因篩查工作中具有更廣泛的應用范圍[2]。已有學者進行了DHPLC相關的方法學比較研究，均提示其敏感性和特異性可達96%～100%[3]，明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳、構象敏感性凝膠電泳、單鏈構象多態性分析等變異檢測技術。DHPLC突變檢測技術與其它方法相比，具有更高的準確性和敏感性[45]。
本組資料應用DHPLC分析鼻咽癌組織XRCC4的突變，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件。由于PCR產物中雜帶的存在會導致目的峰周圍出現干擾峰，這些干擾峰往往會誤判為突變峰形，應用DHPLC分析時筆者通過以下幾種方法來排除干擾峰：(1)通過優化PCR反應條件防止雜帶產生;(2)通過比較部分變性溫度和非變性溫度下的峰形來排除干擾峰，凡是在部分變性溫度下呈現的雙峰或多峰在50 ℃的非變性溫度下同樣表現出來，則提示有干擾峰的存在;(3)通過保留時間來判斷有無干擾峰存在，因為突變引起的雙峰或多峰的保留時間應相差不大。
本研究通過PCR睤HPLC篩查，共檢測了88例患者XRCC4基因各5個片段的PCR產物，在部分變性的溫度下，28例患者的8號外顯子82所擴增的片段中出現雜合峰與純合峰兩種情況，經DNA測序分析證實單個色譜峰樣本未測出突變，雙峰或三峰樣本檢測出突變，即8號外顯子第377位堿基C變成T，此外，不同樣品的PCR產物的8號外顯子在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同，提示8號外顯子具有單一類型的突變。該變異導致126號密碼子的 ser→phe，致使氨基酸殘基發生替代變化(絲氨酸→苯丙氨酸)，這一替代對改變DNA修復能力的作用以及是否影響鼻咽癌細胞DNA損傷修復能力和放射治療療效，還有待于進一步的研究探討。
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