毛細管電色譜的應用及發展

毛細管電色譜的應用及發展

毛細管電色譜(Capillary electrochromatography, 簡稱 CEC)是在毛細管中填充或在管壁涂布、鍵合液相色譜的固定相,然后在毛細管的兩端施加高壓直流電，在電場作用下產生電滲流(Electroosmotic flow ，簡稱EOF）,流動相在電滲流的驅動下通過色譜柱。對中性化合物，其分離過程和HPLC類似，即通過溶質在固定相和流動相之間的分配差異而獲得分離；當被分析的物質在流動相中帶電荷時，除了和中性化合物一樣的分配機理外，自身電泳淌度的差異對物質的分離也起相當的作用。

根據所用色譜柱的形式可分為填充毛細管電色譜（Packed column CEC）和開管柱毛細管電色譜（Open tubular CEC）。CEC以其高效、快速、廣泛的用途、消耗少等優點，已成為當今的研究熱點。

1.1 毛細管電色譜技術歷史回顧  

毛細管電色譜(Capillary electrochromatography, 簡稱 CEC)是在毛細管電泳(Capillary electrophoresis ,簡稱CE)和微柱高效液相色譜(Micro-HPLC) 的基礎上發展起來的一種新的分離技術。

1981年，Jorgenson 和 Lukacs [1]發表了在這一領域具有里程碑意義的工作。他們采用170mm (i.d.) ′ 68 cm的硼硅酸玻璃毛細管，漿法填充10mm ODS填料58cm,使用了在柱熒光檢測器，以乙腈為流動相，在毛細管的兩端施加30kV的高壓，首次用毛細管電色譜分離了毛細管區帶電泳難于分離的兩種中性化合物9-甲基蒽和芘，理論塔板數分別為31,000 和 23,000 ，他們提出了電滲流和柱填充的狀況無關的觀點，Jorgenson 和 Lukacs 的開創性工作和卓越的預見，為這一新技術領域早期的發展奠定了基礎。

1987年J. H. Knox和I. H. Grant[2]對電色譜的分離模式進行了分類，他們認為在電滲流驅動下開管中液流為塞式流，不同于壓力驅動下的拋物線形液流，因此具有較高的分離效率。

1988年T. Tsuda[3]描述了CEC理論塔板數的方程，從理論上解釋了CEC 比HPLC 有較高分離效率的事實，為CEC的發展提供了理論基礎。

由于技術上的限制，直到90年代，毛細管電色譜的研究才得到較快的發展，在開管柱和填充毛細管電色譜中，當前以對后者的研究為主導。

1992年，Yamamoto [4]在680mm′50mm的石英毛細管內填充1.6mm的ODS填料,對不保留的組分硫脲得到243,000/680mm 的理論塔板數。

1994年，N. W. Smith 和M. B. Evans[5]利用CEC 對膽固醇進行雜質分析時，獲得了大于387,000/m 的理論塔板數，所用的CEC柱為40cm′50mm ,3mmODS 填料。

1995年Yan[6]和他的合作者在對16種多環芳香化合物進行電色譜分析時，獲得了400,000/m的理論塔板數。Smith[7] 在毛細管電色譜柱上分離了幾種中性和強極性的堿性藥物，使用離子交換色譜填料實現了離子交換電色譜。

1996年,Yan [8]等還利用毛細管電色譜進行了手性分離，Lloyd[9,10,11]在手性分離方面做了許多研究。到目前為止，大多數的CEC研究集中在諸如中性芳香化合物的分離上。對于蛋白質和多肽的研究報道有：Schmeer[12]、 Dekkers[13]和Euerby[14]結合電噴霧質譜技術分離含一兩種組分的多肽混合物。1997年Wu[15]采用加壓電色譜耦合離子阱/飛行時間質譜的手段，成功分離了6種肽的混合物,在對蛋白質消化產物的分析中,分離了20種以上的消化產物。Wu 等還對流動相的離子強度、pH值、毛細管柱直徑等因素對分離效率和分析速度的影響作了進一步的研究[16]。

從1993年起，發表的CEC論文數量顯著增加，CEC已經成為國際毛細管電泳大會討論的重點專題。近年，國內也有一些研究小組從事填充CEC方面的工作，比較突出的是羅國安小組。他們在這一領域有多篇論文發表[17,18,19,20,21,22]。

目前，毛細管電色譜在藥物分析方面的研究，集中在與藥物相關的雜質分離和手性藥物的分離，分析對象以中性藥物和多環芳香化合物為主，隨著毛細管電色譜技術的不斷完善和提高，將在生物技術、環境保護、農業化學、精細化工產品、食品工業等領域的分析中得到應用，按照毛細管電色譜技術目前的發展勢頭，在可預計的將來，CEC作為一種發展中的分離技術，將有更廣泛的應用前景。

1.2 毛細管電色譜裝置

毛細管電色譜的早期研究是在改裝的CE商品儀器上進行的，隨著研究的深入和對研究前景的良好預期，現在已有商品儀器既可進行電泳模式也可方便地進行電色譜研究。目前，主要是Beckman公司的P/ACE 系列和HP公司的HP3D系列。 檢測器根據分析樣品性質的不同，可選UV 檢測器( 包括DAD ) 、電化學檢測器、LIF及CE－MS等。

1.3  CEC和CE及HPLC的比較

1.3.1  和CE相比CEC的優勢

CEC和CE相比，其最大的優點是CEC既可以象CE一樣分離帶電荷的物質，也可以分離中性物質或兩者的混合物，而無需象毛細管膠束電動色譜（Micellar electrokinetic capillary chromatography ,簡稱MEKC）那樣添加表面活性劑以形成膠束。 對于中性化合物，在CEC中完全是通過它們的色譜性質的差異而獲得分離，如果分析樣品是荷電物質，其分離機制有色譜分配、電泳兩種，從而又可能通過兩者適當的搭配達到所需的選擇性。MEKC 因其含有非揮發性的表面活性劑在和質譜連用時有困難。

其次，對于電泳淌度相近的物質，CE無法分離，而這些物質在CEC中的分配性質可能差異很大，就可以利用CEC分離CE無法分離的化合物。

另外，在HPLC中應用于手性分離的手性試劑幾乎完全適用于CEC。

1.3.2  和HPLC相比CEC的優勢

HPLC給用戶提供了不同口徑的柱子和種類繁多的填料，所有這些HPLC的財富都為CEC的發展提供了良好的條件。由于CEC采用電滲流（EOF）為驅動力，流型更接近于塞式流（Plug-like flow），而HPLC的流型屬拋物線狀的層流（Laminar flow），在壁上的速度為零，中心速度為平均速度的數倍，導致色譜帶的展寬和柱效的降低。降低柱子的直徑，如采用微柱HPLC（Microbore HPLC），或采用更小的填料可以提高柱效，但是會導致極高的背壓（Back pressure），對填料的粒徑有限制，而且對泵的要求極高。

CEC柱不存在柱壓降，可以使用1mm左右粒徑大小的填料，進樣量少，僅為幾個納升，溶劑耗費低，分析時所需的平衡時間短，在檢測方面，CEC采用柱上檢測使檢測的死體積很小，這是CEC分離效率高于HPLC的又一因素。

1.3.3 CEC面臨的問題和未來展望

CEC經過十幾年的發展在分析領域得到了很大的應用，但是世界上不存在完美的事物，從事CEC研究的科學工作者都不可避免地受到一些限制：

①焦耳熱與氣泡的產生：采用較高的電壓可以提高分析速度，但焦耳熱也隨之增加，過熱使柱子產生氣泡，進而中斷電流導致分析過程的終止。采用氣體或導熱良好的液體作散熱介質、在柱子兩端加壓、增加有機溶媒在流動相中的比例、對流動相作徹底的脫氣處理、使用電導率低的兩性電解質緩沖液（Zwitterionic buffer,比如MES、Tris等）代替磷酸或硼酸鹽緩沖等方法可在一定程度上解決散熱的問題。

②檢測的靈敏度：CEC柱的內徑一般在50mm～320mm，這也就是柱上光度法檢測時的光程，這個距離較短，所以檢測器的靈敏度要低于HPLC。而且據本工作小組的研究，柱上檢測存在線性范圍小，在一些參數發生變化時易使測定結果的準確度和精密度降低的問題。增加檢測光程是解決靈敏度問題最簡單的辦法，在CE中可以采用矩形毛細管[23]、將檢測窗口部分彎成Z形[24]、泡形檢測池[25]、高靈敏度檢測池[26]、富集（Stacking）技術[27]、采用大口徑毛細管[28]等方法。CEC可以借鑒CE中的一些方法，在使用大口徑毛細管方面，到目前為止已經發表的最大者為Yan等[28]在1994年采用的320mm（i.d.）CEC柱，由于多孔堵頭（frit）的穩定性問題，最終的檢測并不是在320mm中進行的，只是證實320mm柱子的散熱不是問題，提示我們只要解決多孔堵頭問題就可以提高檢測靈敏度。

③ 定量分析的精密度:由于進樣重現性等方面因素的影響，使CEC精密度較HPLC差，在定量分析方面還不能滿足應用的需要。

1.4  毛細管電色譜柱的制備

毛細管填充柱的制備是進行毛細管電色譜研究的關鍵所在，在某種程度上，正是由于CEC填充柱制備的難度影響了CEC的發展速度。

一根合格的毛細管填充柱需要具備以下性質：

①通透性良好、死體積小、堅固耐用的多孔堵頭

②填充均一的柱床

③柱效高

④批量生產使柱性能重現性好

⑤使用壽命長

毛細管填充柱的制備步驟如下：

① 多孔堵頭的制備：制備毛細管填充柱兩端多孔堵頭，通常以硅膠[9]、水玻璃[29]（硅酸鉀或鈉鹽）、或者兩者的一定比例的混合物[5]燒結而成，也有以多孔聚四氟乙烯[30]做堵頭的報道。

本文采用改進交聯法制備多孔堵頭。

② 填充：填充電色譜柱的方法有：漿法填充(Slurry packing，文獻如[3]) 、干法填充[30](Dry packing)、電動填充[22](Electrokinetic packing) 等。本文采用漿法填充色譜柱。

③ 柱的平衡：當一根合乎要求的CEC柱制備后，使用前需要用流動相充滿柱子，稱平衡柱子。可以采用HPLC泵或手動泵使CEC柱內充滿流動相，也可以采用惰性氣體為動力推動流動相進入柱內進行柱平衡，使柱平衡更方便。

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