實時熒光定量PCR（RealTimePCR）實驗流程（二）

五、cDNA與引物質量檢測
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物濃度10uM)，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補加水至20ul。
　　
　　組份加量
　　
　　2×PCRTaqMix10ul
　　
　　10uMPrimerFW0.5ul
　　
　　10uMPrimerRV0.5ul
　　
　　TemplateDNA1ul
　　
　　ddH2O混勻至20ul
　　
　　混勻，置于TP600PCR儀中。95℃5min;95℃15s，60℃35s，40cycles;72℃5min;4℃pause。
　　
　　取擴增產物各8μl，DL2000分子量標準5μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察。
　　
　　選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。
　　
　　六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況：
　　
　　由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。
　　
　　七、定量PCR檢測：
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對應的cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25ul。
　　
　　組份加量
　　
　　模板(cDNA)/ddH2O1.0ul
　　
　　10uM引物F/R0.5ul
　　
　　2×qPCRMix12.5ul
　　
　　ddH2O11.0ul
　　
　　混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預變性后，95℃15s→65℃35s(熒光檢測)，40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設成一個溫度，只在擴增出現問題時才會考慮設梯度。
　　
　　八、擴增曲線和溶解曲線
　　
　　實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程
　　
　　實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程
　　
　　溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。
　　
　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。
　　
　　如果在熒光背景信號階段出現很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態雜質;
　　
　　如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
　　
　　如果引物二聚體存在則陰性對照會出現抬頭現象，這在Real-TimePCR中很難避免;
　　
　　若是陰性對照的溶解曲線出現和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結果不可用。
　　
　　在溶解曲線中出現雙峰有三種可能：
　　
　　①引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設計引物;
　　
　　②在做基因表達差異時容易出現DNA被擴增峰(只在引物跨內含子時存在)，出現原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA;
　　
　　③擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設計并驗證引物。
　　
　　九、表達差異的計算方法
　　
　　絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數;相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本或是目標轉錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。
　　
　　2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。
　　
　　在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。
　　
　　2-△△CT方法的推導(詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量)
　　
　　補充：在DNaseI消化樣品RNA中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：
　　
　　消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200ulDEPC水。
　　
　　1.向離心管中加入等體積氯仿(約300ul)，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現白色片狀沉淀。4℃14000rpm離心8min，取上清(約250ul)。
　　
　　2.加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。
　　
　　3.4℃14000rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。
　　
　　4.加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。
　　
　　5.瞬時離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(勿吸到管底的沉淀)。
　　
　　6.把離心管放置于超凈臺晾至約5-10分鐘(勿完全干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min后，振蕩30sec，瞬時離心。
　　
　　7.將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20℃保存。