細菌胞漿內鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
細菌胞漿內鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑是一種旨在通過胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光酶標儀下測量不同激發波長下相對熒光峰值的比值，來測定細菌胞漿總鈣離子濃度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細菌胞漿鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。
技術背景
細胞漿鈣離子在調節鈣離子通道，維持細胞內環境鈣離子平衡方面起著重要作用。在細菌中，鈣對于細菌的生長和結構具有重要作用。細胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame
photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要細胞漿分離。Fura-2
AM（acetoxy-methyl
ester），一種具有細胞膜通透性，與鈣離子結合產生熒光的染料，通過其不同激發波長340nm/380nm產生的熒光信號比（散發波長505nm）來精確測定細菌胞漿內鈣離子水平。
產品內容
清理液（Reagent A） 40毫升
染色液（Reagent B） 30微升
介導液（Reagent C） 600微升
飽和液（Reagent D） 2毫升
陰性液（Reagent E） 2毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent B）和介導液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
培養箱：用于染色孵育
100微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器
熒光酶標儀：用于熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察
實驗步驟
樣品準備
準備好1毫升待測的細菌樣品（1 X 108細菌/毫升0
放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
小心抽去上清液
加入1毫升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
小心抽去上清液
重復實驗步驟4至6一次
加入1毫升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
放進冰槽里備用
測定準備
設定好熒光酶標儀：激發波長340nm和380nm，散發波長505nm
測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。
二、熒光酶標儀檢測
準備3個1.5毫升離心管，標記為：細菌樣品管、空白對照管（不含細菌）、最大對照管（含細菌）
分別移取100微升上述準備的細菌樣品到細菌樣品管和最大樣品管里
放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
小心抽去上清液
加入100微升清理液（Reagent A）到細菌樣品管里，混勻細菌顆粒群
加入100微升飽和液（Reagent D）到最大對照管里，混勻細菌顆粒群
加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對照管里
分別加入10微升染色工作液到所有管里，混勻
放進37℃細胞培養箱里孵育120分鐘，避免光照
轉移到100微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板里
即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對照孔RFU340nm、空白對照孔RFU380nm、最大對照孔RFU340nm、最大對照孔RFU380nm
計算樣品細菌胞漿鈣離子濃度
{【（樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）－（空白對照孔RFU340nm/空白對照孔RFU380nm）】÷【（最大對照孔RFU340nm/最大對照孔RFU380nm－樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）】}X（空白對照孔RFU380nm/最大對照孔RFU380nm）
X 315（納摩爾；解離常數）
三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測
移取300微升上述準備的細菌樣品到1.5毫升離心管
加入30微升染色工作液，混勻
放進37℃細胞培養箱里孵育120分鐘，避免光照
放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
小心抽去上清液
小心加入500微升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
小心抽去上清液
小心加入300微升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
移取50微升到載玻片上
蓋上蓋玻片
即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長340至400nm，散發波長505nm（細菌胞漿鈣離子呈現藍色熒光）
注意事項
本產品為20次（顯微鏡）或60次（96孔板）操作
操作時，須戴手套
可以使用熒光分光光度儀檢測
避免使用EDTA等處理樣品
孵育反應完成后即刻進行熒光測定
如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍