不同品牌試劑盒提取土壤DNA的結果對比

1.引言

提取高濃度、大片段、多樣性程度高、具有代表性的土壤微生物總DNA對土壤微生物多樣性研究至關重要。然而，土壤是一個非常復雜的異質體系，其中含有的腐植酸及腐植酸類似物、酚類化合物、重金屬離子等，在DNA提取過程中如不能有效去除，將直接影響后續的PCR擴增、核酸雜交、內切酶消化等分子操作。

用傳統微生物學方法對復雜微生物生態系統進行研究必須首先進行微生物的分離培養。由于土壤微生物生態系統極為復雜及培養條件的限制，可在實驗室培養的微生物還不到土壤微生物總數的1％，相當多的微生物因無法人工培養而未被認識^[1]。

土壤微生物DNA的提取純化是一個耗時、繁瑣的過程，許多學者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。20世紀80年代中期以來，微生物學家開始采用免培養分子微生物生態學法直接對土壤微生物進行研究^[2]，其方法必須提取土壤微生物群落的DNA。Volossiouk^[3]等使用液氮研磨及SDS(十二烷基磺酸鈉)破解微生物細胞提取土壤DNA，Tsai^[4]等則采用溶菌酶和SDS法提取土壤DNA，而這些方法所提取的DNA雜質較多，嚴重影響后續研究結果^[5-6]。后來，Bourrain等^[7]從活性污泥中以及LaMontagne等^[8]從堆肥中提取了微生物群落的DNA。但是，目前仍然沒有一種快速、高效、低成本且高質量的土壤DNA提取方法。本文購買了市面上常用的土壤DNA試劑盒，就提取效果進行了對比。

2.材料與方法

2.1材料

用于DNA提取的土壤樣品采自無錫市惠山區惠山中央公園草坪的貧瘠土(1～10 cm表土；樣品編號1)、池塘邊的活性污泥（樣品編號2），以及小樹林的腐殖土(1～10 cm表土；樣品編號3)。

2.2方法

2.2.1 分組

設置三個實驗組：

（A）O公司 （Lot. M****-02）；

（B）M公司 （Lot.***545）；

（C）Bioteke （貨號：AU46212）。

2.2.2 DNA提取

嚴格按照試劑盒步驟提取土壤DNA，比較不同試劑盒處理的DNA提取效率，并通過凝膠電泳和PCR擴增分別確定不同試劑盒提取后DNA的提取量及擴增16S rRNA基因的可行性。

2.2.3 PCR擴增

用細菌通用引物對27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' PCR擴增不同處理后提取的土壤和活性污泥微生物群落中的16S rRNA基因。PCR循環為：94℃，3 min，1次循環；94℃，30 s，30次循環；55℃，30 s，30次循環；72℃，1 min，30次循環；72℃，5 min，1次循環。

3.結果與分析

3.1提取的DNA濃度及完整性的對比結果

表1土壤基因組DNA超微量分光光度計檢測結果

圖1土壤基因組DNA電泳圖

圖2 土壤樣品16S rRNA基因PCR擴增產品電泳圖

3.2提取的DNA濃度及完整性的對比結果分析

1. A組提取的DNA鹽度尚可，但是含有的PCR干擾因子較多，PCR擴增不出條帶；

2. B組三種土壤有提取的核酸只有兩種滿足PCR條件；

3.C組土壤提取試劑盒提取的土壤DNA，鹽殘留少，純度高，提取的DNA中PCR抑制因子低，提取出的DNA可正常擴增，條帶單一且清晰。

4. 參考文獻

[1]Torsvik V L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems[J]. Current Opinion in Microbiology, 2002, 5(3):240-245.

[2]Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial Evolution, Diversity, and Ecology: A Decade of Ribosomal RNA Analysis of Uncultivated Microorganisms[J]. Microbial Ecology, 1998, 35(1):1-21.

[3]Volossiouk T, Robb E J, Nazar R N. Direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms.[J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(11):3972-3976.

4]Tsai Y L, Olson B H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments.[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1991, 57(4):1070-4.

[5] Bürgmann H, Pesaro M, Widmer F, et al. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil[J]. J Microbiol Methods, 2001, 45(1):7-20.

[6]王嘯波, 唐玉秋, 王金華,等. 環境樣品中DNA的分離純化和文庫構建[J]. 微生物學報, 2001, 41(2):133-140.

[7]Bourrain M, Achouak W, Urbain V, et al. DNA Extraction from Activated Sludges[J]. Current Microbiology, 1999, 38(6):315-319.

[8]Lamontagne M G, Jr M F, Holden P A, et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis.[J]. Journal of Microbiological Methods, 2002, 49(3):255-264.