產品說明
病菌檢測系列可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結果。本產品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為103 CFU/ml。
產品組成（96測試）
試劑 | 含量 | 作用 | |
孔1 | 反應液-uidA | 23μl/孔 12孔/排 8排 （本產品使用12聯PCR管分裝，每排含12種反應液各23ul） | 內參 |
孔2 | 反應液-ipaH | 鑒定EIEC | |
孔3 | 反應液-pic | 鑒定EAEC | |
孔4 | 反應液-aggR | 鑒定EAEC | |
孔5 | 反應液-astA | 鑒定EAEC | |
孔6 | 反應液-stx1 | 鑒定EPEC與EHEC | |
孔7 | 反應液-stx2 | 鑒定EPEC與EHEC | |
孔8 | 反應液-bfpB | 鑒定EPEC與EHEC | |
孔9 | 反應液-escVa | 鑒定EPEC與EHEC | |
孔10 | 反應液-lt | 鑒定ETEC | |
孔11 | 反應液-stp | 鑒定ETEC | |
孔12 | 反應液-sth | 鑒定ETEC | |
NG-Ecoli | 100μL × 1支 | 陰性對照 | |
NG-DW | 100μL × 1支 | 空白對照 | |
PG-Ecoli | 100μL × 1支 | 陽性對照 | |
Loading Buffer | 600μL×1支 | 電泳上樣緩沖液 |
◆ 所需儀器
ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR擴增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設備。（使用熒光定量PCR儀進行定性判讀時則無需電泳設備）
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。
◆ 樣品處理
參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌。建議使用試劑配套細菌基因組DNA提取系列產品。
◆ 實驗操作
1．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）
取所待檢樣品數+3的12聯反應管，將試劑完全解凍，分離心30s。離心后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應液中分別加入2μL模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應管中）。
加樣示例：（有2個待測樣品）
取5排12聯反應管，按順序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加樣品1，第四排全部加樣品2，第五排全部加PG-Ecoli。
蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
2. 擴增反應（擴增及產物分析區）
按下列條件設置擴增反應：（如需使用熒光法進行檢測請選擇FAM通道）
PCR循環 | 熒光收集位點 | ||
95℃ | 10分鐘 | 1個循環 | — |
95℃ | 30秒 | 30個循環 | — |
63℃ | 30秒 | — | |
72℃ | 90秒 | ※ | |
72℃ | 5分鐘 | 1個循環 | — |
3. 產物電泳（擴增及產物分析區）
稱量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度宜為3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當瓊脂糖凝膠完全凝結硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰極端。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm~2mm。將 5μL PCR產物與1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應產物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據公式：電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm計算并設定電泳儀電壓數值；啟動電壓開關，電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準。電泳30min~45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結果，拍照并記錄數據。
可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。
推薦使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp條帶的Marker。
結果分析
陰陽性判讀：
進行電泳檢測時，需對比Marker進行判斷，當目的靶標對應位置出現單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性；否則為該靶標檢測為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測時，檢測孔Ct≤30時判斷該孔為陽性；當檢測孔Ct＞30時，該檢測孔為陰性）
示例電泳圖
有效性判讀：
需同時滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中uidA泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件，則實驗無效，需重復實驗；如重復后結果仍為無效，請于本公司技術支持聯系。
結果判讀：
在實驗有效的情況下，可根據下表進行判讀：
致瀉大腸埃希氏菌類別 | 目標條帶的種類組合 | |
EIEC | ipaH（＋） | uidA （＋／－） |
EAEC | aggR，astA，pic中一條或一條以上陽性 | |
EPEC | bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－） | |
STEC/EHEC | stx1，stx2中一條或一條以上陽性，eae（＋／－），bfpB（－） | |
ETEC | lt，stp，sth中一條或以上陽性 |
97%以上大腸埃希氏菌為uidA陽性，可參考陰性對照中該基因檢測結果判斷擴增效果；
當結果判定為EPEC陽性時，若bfpB靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若bfpB靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC；
當結果判定為STEC/EHEC陽性時，若eae靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若eae靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：擴增及產物分析區。
分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒。
5．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。