目標circRNA的機制研究 a RIP-qPCR：挑選功能最為明顯的1個circRNA做RIP-qPCR實驗，檢測circRNA是否與AGO2蛋白結合。（AGO2是circRNA發揮海綿作用的指示蛋白） b RNA pull down：對上述circRNA進行RNA pull down實驗，拉下來的RNA進行定量PCR檢測，檢測生信預測中與該circRNA結合的10-20疾病miRNA。 c luciferase assay：根據上步結果為circRNA挑選3個左右的miRNA做后續熒光素酶實驗(miRNA與circRNA表達趨勢一致)，分別構建circRNA的熒光素酶載體，miRNA結合位點突變的熒光素酶載體。 將circRNA熒光素酶載體與3個miRNA mimics共轉染至細胞，檢測熒光活性，證明環狀RNA和miRNA mimics的結合。 d miRNA功能實驗：選定1個miRNA研究其對某一確定細胞表型和靶基因表達水平的影響（如：遷移）； e 恢復性實驗：分別研究：單獨轉染nc mimics或單獨轉染miRNA mimics或單獨轉染環狀RNA過表達質粒，及共轉染環狀RNA+miRNA mimics對某一確定細胞表型和環狀RNA表達水平的影響。 f 回補性實驗：敲除circRNA后，過表達靶基因，檢測靶基因是否能逆轉circRNA敲除導致的表型變化。
既然是真情回饋，那么小編在這兒就給大家透露一個更容易get的研究海綿機制的思路如下圖。可以同時做一下circRNA-seq和AGO2 RIP-seq，這樣重疊部分的結果便是可能發揮海綿作用的circRNA。進而通過RNA pull down-WB反向驗證circRNA與AGO2的相互作用，其他功能實驗與上述一致。
可如果我的circRNA不是海綿機制，咋辦？別怕，小編給你出大招！ circRNA結合功能蛋白： 當你發現自己的circRNA不是發揮海綿作用的時候，是不是有種淚奔的感覺？ 別怕，小編這就給你吃一顆定心丸。原來circRNA不僅可以與miRNA結合發揮海綿作用，還可以結合功能蛋白發揮作用呢！下面這篇就是很好的例子！和大家一樣，這篇文章的作者也是先通過AGO2 RIP實驗驗證了他的circANRIL是否結合AGO2，但不幸的是，結果證實他徹底的和miRNA海綿say goodbye了，頓時小編也是捏了一把冷汗。可作者竟然奇跡般地扭轉了局勢，通過RNA pull down探索了circANRIL上結合的蛋白，并通過RIP反向證實了circRNA是通過與PES1蛋白結合參與了rRNA的成熟過程。想來功夫不負有心人，這篇文章也是成功地發表在Nature communication上[5]。
circRNA順勢調控來源基因表達： 這里小編給大家準備了一個被掩藏許久了的環狀機制：circRNA順勢調控來源基因表達的研究思路，即通過特異的RNA-RNA互作來調控轉錄。
這篇文獻，作者首先通過CLIP-seq（檢測RNA結合蛋白下游的RNA）發現RNA聚合酶II上結合了一些circRNA。并且通過鑒定，發現是外顯子與保留在外顯子之間的內含子形成的環狀RNA，命名為外顯子-內含子circRNAs（EIciRNAs），其中顯著富集的circEIF3J和circPAIP作為后續研究對象。研究這通過FISH定位發現其定位于細胞核，這提示作者可能不能走miRNA海綿的路子了。So what？ 作者通過反義核苷酸技術沉默circEIF3J和circPAIP后檢測來源基因表達，證實了其可調控來源基因表達。RNA-DNA共定位FISH也證實EIciRNAs與其來源基因共定位于細胞核中。此外這兩個EIciRNAs與Pol II互作關系也都使作者提出一個大膽的猜想：EIciRNAs可能對其來源基因有調控作用。 帶著這樣的猜想，接下來作者先后通過RNA pull down（檢測RNA與RNA/蛋白作用）和CHIRP（是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。）實驗分析了與兩個EIciRNAs相互作用的蛋白及RNA。結果發現EIciRNAs不僅可以與Pol II結合，還與U1A和U1C snRNP結合（它參與真核生物細胞核中RNA的加工。snRNA和許多蛋白質結合在一起成為小核核糖核蛋白(snRNP即small nuclear ribonucleoproteins)，參與信使RNApre-mRN的剪接，使后者成為成熟mRNA。），且在細胞核內互作（FISH）。CHIRP實驗證實EIciRNAs同Pol II、U1 snRNP共同結合于其來源基因轉錄起始位點上游300bp處，并且U1 snRNP的結合是必需的[8]。
circRNA翻譯蛋白質： 假如這一切都不足以吸引你的眼球，那么接下來的這個案例可能會讓你“跌破眼鏡”。最初我們認為circRNA屬于非編碼RNA，不能發揮編碼蛋白質的功能，那么事實真的如此么？Cell Research[3]這篇文章便告訴你：大錯特錯！環狀RNA沒有游離的5’和3’端，因此如果可以翻譯的話一定是通過不依賴于5’帽子結構的方式。根據目前報道的環狀RNA翻譯蛋白的調控元件包括IRES和m6A修飾兩種途徑。
已知一些mRNA可以不依賴于帽子結構而靠一個叫內部核糖體進入位點(IRSE)的順式調控元件來從mRNA的中間啟動翻譯，作者基于這種思想，檢測發現自己的環狀RNA上并沒有IRES，卻同樣可以翻譯蛋白。然而一直有報道稱m6A可調控翻譯，但并沒有系統的研究，作者大膽猜想是否環狀RNA上也發生了m6A修飾，并調控蛋白翻譯呢？
結果不出所料，環狀RNA的翻譯可被RNA甲基化酶調控。作者通過一系列實驗證實YTHDF3可識別circRNA上發生的m6A修飾，并招募翻譯起始因子eIF3A和eIF4G2等，起始蛋白翻譯。
說道翻譯蛋白質的研究思路，稍微復雜一些，那么小編給大家總結一下。 1. 翻譯啟動元件預測分析： IRES是internal ribosome entry site的簡寫，是一種具備募集核糖體并實現核糖體組裝和后續閱讀框翻譯蛋白的RNA調控元件。 2. 閱讀框預測： 閱讀框是Open Reading Frame的簡寫，指在核酸序列中從ATG開始（RNA中是AUG），三個堿基一組，直至出現TAA，TAG或TGA（RNA中A變成U）終止密碼子的序列。 3. 載體表達驗證實驗： 通過構建正常元件和元件突變載體，即把預測到的IRES或m6A修飾位點突變掉，看后續的翻譯是否正常進行。 4. 閱讀框表達驗證實驗： 通過在原有的閱讀框前端增加標簽序列，包括3×Flag等標簽，驗證閱讀框產物在生理條件下是否可以實現。 5. 內源性翻譯產物鑒定： 通過制備特異性抗體進行Western等檢測實驗。這部分需要進行抗體特異性證明實驗，包括模擬翻譯產物的過表達和敲除實驗等，特異性可以通過WB和IP下來質譜鑒定。 6. 核糖體結合分析： 基于蔗糖密度梯度離心的核糖體分離技術，鑒定環狀RNA上是否結合核糖體，以及結合的多少。 7. 翻譯產物過表達和敲低（除）實驗： 通過構建過表達或敲低/敲除體系，看不同含量的翻譯產物對細胞生理指標的影響情況。 3.環狀RNA項目國自然申請建議 (1)避免單純設計表達譜的研究內容。盡早進行表達譜分析，找到有研究價值的目標環狀RNA，并開展一些簡單的驗證實驗，最好能形成大致的功能機制研究的輪廓。 (2)開展新穎的環狀RNA研究方向。包括對尚未報道或極少報道的病理或生理模型相關的環狀RNA篩選鑒定，或者機制研究方向上，比如miRNA海綿，與功能蛋白相互作用，與表觀水平結合，翻譯蛋白質方向等。 (3)利用多種有效地分析環狀RNA與其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down，CLIP等實驗技術，如果能得到有效數據，會在國自然科學基金申請中增色不少。 參考文獻 1.Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.[J]. Nature, 2013, 495(7441):333. 2.Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441):384-388. 3.Yun Y, Fan X, Mao M, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J]. Cell Research, 2017, 27(5):626. 4.Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature Communications, 2016, 7(11215):11215. 5.Holdt L M, Anika S, Kristina S, et al. Circular non-coding RNAANRILmodulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans:[J]. Nature Communications, 2016, 7:12429. 6.Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22. 7.Yang Y, Gao X, Zhang M, et al. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2018, 110(3). 8.Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2015, 22(3):256.