分子生物學相關實驗步驟及注意事項（一）

剛進實驗室的小伙伴們，當你們在進行RNA的提取，RT-PCR和QPCR實驗時，是否會有這樣的感受，明明是按照實驗步驟往下做的，實驗結果卻不如人意，甚至很糟糕呢？小編我也曾經被實驗狠狠地虐過呢~為了減少實驗對親們的打擊，在此獻上自己在實驗過程中的一些小經驗，希望能幫助到各位小伙伴們~

（一）RNA提取篇

在RNA提取過程中，嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是本實驗成功的關鍵。對于人、動植物組織、細菌、細胞等多種RNA的提取，Trizol法效果良好，可同時分離一個樣品內的RNA/DNA/蛋白質。Trizol裂解細胞，溶解細胞內含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。

如果對RNA純度要求極高或者樣品難以提取，也可以選擇使用RNA提取試劑盒。有同學用過國內的天根，效果還好。小編曾用過Omega的RNA提取試劑盒，效果也挺好的，Promega的總RNA提取試劑盒對多種樣本的小量純化提取效果也還不錯。

動植物總RNA提取——Trizol法的具體步驟如下：

1、將組織物研磨后，取50-100mg加入至1mlTrizol中，充分混合裂解。樣品總體積最好不要超過所用Trizol體積的10%。

2、研磨液室溫靜置5-10min后，加入200μl氯仿，蓋緊EP管，置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩15s。然后冰上靜置10min。

3、于4℃，10000g離心15min，吸取上層澄清的液體500μl移至另一潔凈的EP管內，并加入等體積（500μl）的異丙醇，輕輕混勻后靜置10min。

4、于4℃，10000g離心10min去上清。離心后可能在管壁或管底出現膠狀白色沉淀物，小心操作，避免沉淀物流失。

5、加入1ml 預冷的75%無水乙醇（DEPC水配置）至EP管內，并用手指輕輕彈起沉淀物，然后4℃，10000g離心5min。

6、小心棄去上清液，于室溫靜置干燥2-5min，注意不能過分干燥。

7、將RNA溶于20-50μl DEPC水，必要時可55-60℃水浴3-5min。水浴過程中，EP管蓋需密閉。 所提RNA可用于后續試驗或者保存于-80℃。

注意事項：

1、提取之前，將所需實驗物品全部放置于超凈臺內，并用祛RNA酶水噴灑臺面，紫外照射15min。

2、提取過程中均需佩戴口罩和手套操作，并經常更換手套（一次性手套）。

3、提取過程中，超凈臺周圍應盡量避免人員走動，以免RNA酶趁虛而入進入超凈臺。

4、樣品需充分勻漿裂解，否則易造成RNA提取量低。

5、步驟3中，離心管從離心機拿出來的時候要輕巧，以免管內物質震蕩導致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定要動作輕，切忌吸取太多，少量即可，吸到400-500μl就OK了，再多就容易碰到下層沉淀了。

6、步驟5中，一定把沉淀彈起來，讓浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機試劑，然后再離心。但是有時也會使一些雜質沉淀下來。

7、最后一步溶解RNA時一定要充分。組織提取出來的量還是挺大的，一般50μl左右。